השפעת אנטיאוקסידנטים טבעיים על ביטוי ופעילות החלבון SIRT1 בתאי סרטן הערמונית מאדם

בס"ד השפעת אנטיאוקסידנטים טבעיים על ביטוי ופעילות החלבון SIRT1 בתאי סרטן הערמונית מאדם שי לובל 066462391 עבודה זו מוגשת כחלק מהדרישות לשם קבלת תואר מוסמך בפקולטה למדעי החיים של אוניברסיטת בר-אילן רמת גן, ישראל תשע"א 1

נעשתה זו עבודה בהדרכתם של פרופ' שלמה גרוסמן וד"ר חיים כהן מן הפקולטה למדעי החיים ע"ש מינה ואבררד גודמן של אוניברסיטת בר-אילן. 2

תודות למנחי ומורי - פרופ' שלמה גרוסמן וד"ר חיים כהן תודה מעומק הלב על ההדרכה, ההשקעה, האמון והאוזן הקשבת. למשפחתי הורי, רעייתי רוית ואחי היקרים על העידוד והתמיכה לאורך כל הדרך. לחברי המעבדה מרגלית ברגמן, אורטל דנינו, מירי בן-דהן, מורן מזוז, בתיה לרר, יריב כנפי, יהב דיקשטיין, גלעד גיבור, נועם מעוז, מורן רטהאוס, גיל ראובן, מיה גרינבלום, ליאת נחום, שי לי בר, אסף גרטלר, שאול ברט, שושנה נאמן, סיון אלחנטי, דניאל מרטון, יעל בוכניק ואורשי גבאי, על עזרתם המקצועית ועל סיועם הרב. עבודה זו מוקדשת לזכרו של סבי מורי, ר' משה וינשל ז"ל, היקר באדם, העניו, הכשר, אוהב הבריות והארץ, אשר ליווני בעידוד רב לאורך כל תקופת חיי "ממשה עד משה לא היה כמשה". יהי זכרו ברוך. 3

תוכן עניינים תקציר...א מבוא...1 2.1 הגידול הסרטני...1 2.2 סרטן הערמונית...2 2.3 תהליך ההזדקנות...3 4... HAT(Histone Acetyltransferase) & HDAC(Histone De-Acetylase) 2.4 2.5 מעכבים נפוצים של דה-אצטילזות...6 6... TSA Trichostatin A 2.5.1.1.2 6... NAM Nicotinamide 2.5.2 2.5.3 סירטינול - Sirtinol 6... 2.6 מפעילים נפוצים של דה-אצטילזות...6 6... Resveratrol 2.6.1 7... SRT-1720 2.6.2 2.7 משפחת הסירטואינים...7 2.8 החלבון 9... SIRT1 2.9 סובסטרטים שונים של החלבון...9 SIRT1 2.10 החלבון SIRT1 וגידולים סרטניים: גורם או מונע?...11 2.11 החלבון SIRT1 וסרטן הערמונית...11 2.12 מקור חומרי הטבע...13 13... NAO 2.12.1 14... Cucurbitacin E glucoside 2.12.2 16... 1,3-diCaffeate Quinic Acid 2.12.3 17... Cyanidin-3-rhamnoglucoside 2.12.4 3. מטרות המחקר...18 4. חשיבות המחקר...19 5. חומרים ושיטות עבודה...21 5.1 חומרים 21... 5.1.1 כללי 21... 5.1.2 מרקרים 21... 5.1.3 ערכות 21... 5.1.4 רשימת נוגדנים ומיהול באנליזת...21 Western Blot 4

Lysis buffer 5.1.5 להפקת חלבונים 21... 5.1.6 בופר העמסת חלבונים )Sample buffer( X5 22... 5.1.7 מרכיבים עבור resolving gel בריכוז )5ml( 11% 22... 5.1.8 מרכיבים עבור stacking gel בריכוז )4ml( 5% 22... 5.1.9 בופר הרצה לחלבונים (Running Buffer) X10 23... 5.1.10 בופר העברת חלבונים (Transfer buffer) X10 23... 5.1.11 בופר העברת חלבונים (Transfer buffer) X1 23... 5.1.12 תמיסת חלב 23... 5% 5.1.13 בופר 24... TBST X1 LB 5.1.14 נוזלי 24... Ampicillin וריכוזי עבודה...24 5.1.15 5.1.16 בופר שטיפה )בופר A(...24 5.1.17 בופר הטענה )בופר B(...25 5.1.18 בופר אלוציה )בופר C(...25 5.1.19 בופר אחסון...25 5.1.20 בופר ריאקציה למבחן 25... Flour de Lys 5.2 שיטות עבודה...26 5.2.1 בידוד וזיהוי חומרי הטבע...26 5.2.1.1 הפקת NAO מעלי תרד...26 5.2.1.2 הפקת החומר Cucurbitacin E glucosides מהפרי של אבטיח הפקועה... 26 5.2.1.3 הפקת החומר 1,3-dicaffeate quinic acid מהעלים של טיון דביק...27 5.2.1.4 רכישת חומרי הטבע Resveratrol ו- 27...)C3R( Cyanidin-3-Rhamnoglucoside 28.. 5.2.2 הפרדת NAO מעלי התרד, מיצוי מתנולי מטיון דביק ומיצוי ה- CC מאבטיח הפקועה על גבי HPLC 5.2.3 זיהוי המבנה המולקולארי ע"י שימוש ב-...28 NMR 5

5.2.4 מדידת הפעילות האנטיאוקסידנטית של חומרי הטבע ע"י שימוש ב- assay... ABTS + 28 5.2.5 הפקת חלבון SIRT1 רקומביננטי...29 5.2.5.1 הפקת חלבון SIRT1 רקומביננטי מסומן ב- tag X6 His מחיידקי...29 E.coli 5.2.5.2 ניקוי חלבון רקומביננטי מאימידזול...31 5.2.6 מבחן פלורוסנטי לפעילות דה-אצטילציה Assay( )Flour de Lys 31... 5.2.7 תרביות תאים...32 5.2.8 בדיקת שגשוג של תאים )שיטת )XTT...32 5.2.9 חלבונים 33... 5.2.9.1 הפקת חלבונים מתאים אנימליים...33 5.2.9.2 קביעת ריכוז חלבון...33 33... Western blot analysis 5.2.9.3 5.2.9.4 צביעת חלבונים ב Coomassie Brilliant Dyes על גבי ג'ל פוליאקרילאמיד... 34 5.2.10 השתקת החלבון SIRT1 באמצעות 34... sirna 5.2.11 ניתוח סטטיסטי של התוצאות...35.6 תוצאות 36... 6.1 הפרדת חומרי הטבע...36 6.1.1 הפקת NAO מעלי תרד ובידוד הפוליפנולים Flavonoid glucoside ו- acid...36 p-coumaric 6.1.2 הפקת Cucurbitacin E glucosides מהפרי של אבטיח הפקועה...37 6.1.3 הפקת 1,3-dicaffeoylquinic acid מעלי טיון דביק...37 6.2 מדידת הפעילות האנטיאוקסידנטית של חומרי הטבע ע"י שימוש ב- assay 39... ABTS + 6.3 הפקת אנזים SIRT1 רקומביננטי...41 6.4 השפעת חומרי הטבע על פעילות דה-אצטילציה in vitro של האנזים...42 SIRT1...43 של האנזים SIRT1 in vitro על פעילות דה-אצטילציה Resveratrol...45 של האנזים SIRT1 in vitro על פעילות דה-אצטילציה NAO 6.4.1 השפעת 6.4.2 השפעת 6.4.3 השפעת Cucurbitacin על פעילות דה-אצטילציה in vitro של האנזים...47 SIRT1 6.4.4 השפעת 1,3-diCQA על פעילות דה-אצטילציה in vitro של האנזים...49 SIRT1 6.4.5 השפעת C3R על פעילות דה-אצטילציה in vitro של האנזים...51 SIRT1 6.5 השפעת טיפול ב- NAO על חיות תאי...54 PC3 6.5.1 השפעת טיפול ב- NAO על שגשוג של תאי...54 PC3 6.5.2 השפעת זמן הטיפול ב- NAO על שגשוג של תאי...55 PC3 6.5.3 האם השפעת הטיפול ב- NAO על שגשוג תאי PC3 מתווכת באמצעות החלבון?SIRT1...56 6

6.6 השפעת NAO על רמת ביטוי החלבון SIRT1 בתאי...61 PC3 6.7 השפעת NAO על פעילות הדה-אצטילציה של החלבון SIRT1 בתאי...61 PC3.7 דיון 63....8 ביבליוגרפיה 71... תקציר באנגלית I... 7

תקציר סרטן הערמונית הינה מחלה הקשורה בהזדקנות. עפ"י הערכות של האיגוד האמריקאי לסרטן,.1 הסיכוי של גבר לחלות בסרטן הערמונית עולה משמעותית עם העלייה בגיל, מ- 1:2,500 בגיל 45 ל- 1:9 בגיל 75. מכאן נראה, כי ישנה חשיבות לזהות ולהבין את הקשר בין המנגנונים של תהליך ההזדקנות לבין סרטן הערמונית. מחקר קודם הבדק קשר זה ]1[ הראה שהחלבון,SIRT1 חלבון HDAC תלוי,NAD+ מבוטא ביתר באופן משמעותי בתאי סרטן ערמונית מאדם, תאי,PC3 לעומת תאי אפיתל בריאים מערמונית באדם, תאי,PrEC ברמת החלבון ובפעילותו האנזימתית. SIRT1 לאור האמור לעיל, שיערנו שהורדת רמת החלבון ועיכוב פעילותו האנזימתית תתבטא בעיכוב התפתחות סרטן הערמונית. SIRT1 מטרת עבודה זו הייתה למצוא חומר טבע, שאינו רעיל, המוריד את רמות החלבון ואת פעילותו האנזימתית בתאי.PC3 לשם כך, סרקנו ארבעה חומרי טבע, בעלי פעילות אנטיאוקסידנטית, ובדקנו את השפעתם על פעילותו האנזימתית in vitro של החלבון.SIRT1 מבין ארבעת חומרי הטבע שנבדקו, מצאנו כי תערובת פוליפנולית המופקת מעלי תרד, עיכבה בצורה החזקה,)Natural Antioxidant( NAO ביותר את פעילותו האנזימתית in vitro של החלבון.SIRT1 במודל תרביות תאים מצאנו כי ה-.PC3 הוריד את רמת החלבון SIRT1 בתאי בנוסף מצאנו ש- NAO מעכב את פעילותו NAO האנזימתית של החלבון SIRT1 בתאי,PC3 כפי שבא לידי ביטוי בעליה ברמת האצטילציה של,NAO פקטור השעתוק p53. פעילות זו של ה- כמונע ומקטין את התפתחות סרטן הערמונית, באמצעות הורדת הביטוי ועיכוב פעילות הדה-אצטילציה של החלבון,SIRT1 ובאמצעות מנגנונים נוספים ]48[, מצביעה על הפוטנציאל לשימוש קליני בחומר זה. 8

2. מבוא 2.1 הגידול הסרטני סרטן הוא שם כולל למחלה העלולה להתרחש באיברים ורקמות שונות, במהלכה תאים מתחלקים השכנה. בצורה בלתי מבוקרת, פולשים לרקמות שכנות ומתרבים על חשבון התאים ברקמה תאי סרטן הינם תאים אשר עברו שינויים גנטיים ואיבדו, בין היתר, את הבקרה על מנגנוני החלוקה שלהם. איבוד המנגנונים הללו גורם להם לחלוקה בלתי מבוקרת וליצירת גוש סרטני ברקמה, שמסוגל לחדור ולהתפשט לרקמות בסביבה ואף בכל הגוף, בתהליך הנקרא יצירת גרורות. התהליך הסרטני הינו תהליך רב-שלבי בו מתרחשים שינויים מולקולאריים בתאי הגוף, כגון ביטוי של גנים מעודדי סרטן )oncogenes( או השתקה של גנים מעכבי גידולים סרטניים שינויים בגנים אלו יכולים להיגרם ע"י קרינה, כימיקלים.)tumor-suppressor genes( מסרטנים )קרצינוגניים(, תורשה של גנים שעברו מוטציה, וירוסים, חיידקים גורמי סרטן ופגיעה ע"י רדיקלים חופשיים. התפתחות גידול סרטני הוא תהליך שאורך שנים רבות, ומורכב ממספר שלבים מוגדרים: promotion,intiation ו-.progression שלב ה- intiation יכול להיגרם ע"י מוטציה נקודתית באחד הגנים ממשפחות הפרוטואונקוגנים או ממשפחת ה-,tumor suppressor gene אשר,promotion מקנה יתרון סלקטיבי לתא בהשוואה לתאים אחרים. בשלב הבא, שלב ה- התא שמכיל מוטציה מתחלק באופן מואץ על חשבון תאים אחרים ברקמה בשל אותו היתרון הסלקטיבי שנגרם על ידי המוטציה.,progression בשלב ה- השלב הארוך ביותר, מתווספות מוטציות רבות נוספות בגנים קריטיים לתפקוד תקין של התא וכך מאפשרות את המשך תפקודו של התא הסרטני ]2,3[. כפי שהוזכר לעיל, המוטציות השונות בגנים עשויות להיגרם מקרצינוגנים כימיים, וירוסים וקרינה מייננת. הקרינה המייננת גורמת לשברים וטרנסלוקציות בכרומוזומים. הקרצינוגנים הכימיים גורמים לרוב למוטציות נקודתיות, ואילו הוירוסים מחדירים דנ"א זר לגנום. כאשר נזקים אלו פוגעים בגנים שמווסתים את מחזור התא, יכול התא לאבד את הבקרה על חלוקתו ולהתחיל ליצור שבט של תאים מותמרים כמוהו. 9

2.2 סרטן הערמונית בלוטת הערמונית ממוקמת מתחת לשלפוחית השתן ועוטפת את חלקה העליון של השופכה, הצינורית המוליכה את השתן משלפוחית השתן. בלוטת הערמונית מייצרת נוזל, בו נישאים תאי הזרע בעת הפליטה. תמונה מס' 1: בלוטת הערמונית. )http://www.cambridgeurologypartnership.co.uk/images/prostate%20anatomy.jpg) סרטן בלוטת הערמונית,,Prostate cancer הוא מחלה בה מתפתח גידול סרטני בבלוטת הערמונית. התפתחות הגידול בבלוטת הערמונית הינו תהליך רב שלבי, כאשר חלה התפתחות מגידול קטן ובדרגה היסטולוגית נמוכה לגידול פעיל בדרגה גבוהה. התפתחותו הראשונית של הגידול תלויה בהורמונים )אנדרוגנים טבעיים(, ואילו בשלבים מאוחרים עם התפתחות יותר, הגידול, נפסקת התלות ההורמונאלית. סרטן הערמונית הינו גידול מסוג אדנוקרצינומה, דהיינו גידול ממאיר ממקור אפיתליאלי הנמצא בבלוטת הערמונית, כאשר תאי הגידול יוצרים מבנים הדומים לבלוטת הערמונית. בסרטן הערמונית, התאים הסרטניים עשויים להתפשט מחוץ לבלוטת הערמונית וליצור גרורות סרטניות, בעיקר בקשרי הלימפה ובעצמות. 11

הגורמים להתפתחות סרטן הערמונית אינם ברורים לגמרי, אך ברור שגורם הסיכון העיקרי להתפתחות גידול בבלוטת הערמונית הוא הגיל. סרטן הערמונית אינו שכיח בקרב גברים שגילם עד 41 שנים, אולם לאחר גיל זה, שכיחותו הולכת ועולה עם הגיל ]4,5[. נכון לשנת 2111, סרטן הערמונית נחשב לסרטן השכיח ביותר בקרב גברים בארה"ב ולגורם המוות הראשי בקרב אוכלוסיה זו, אחרי סרטן הריאות. תמונה מס' 2: סרטן הערמונית הינה מחלה תלוית-גיל (מתוך.(American Cancer Society עפ"י ממצאים אלו, נראה כי ישנה חשיבות רבה להבין את הקשר והמנגנון המולקולארי שבין תהליך ההזדקנות לבין סרטן הערמונית. 2.3 תהליך ההזדקנות תהליך ההזדקנות הוא תהליך במהלכו ישנה ירידה בתפקוד של תהליכים פיזיולוגיים ומטבוליים שונים. תהליכים אלו נפגעים כתוצאה משינויים מולקולאריים, גנטיים וסביבתיים. שינויים אלו מורידים את יכולת הגוף, הרקמה והתא להתמודד עם עקות שונות ]6[. קיימות מספר תיאוריות המסבירות את תופעת ההזדקנות. אחת התיאוריות היא תיאוריית כדור השלג. עפ"י תיאוריה זו, ישנה פגיעה לאורך זמן של מקרומולקולות תאיות כמו חלבונים, דנ"א, רנ"א, חומצות שומן ועוד. עם הזמן, כמות הנזק הכללית הולכת ומצטברת, וכך עולה הסיכוי לפגיעה במנגנונים חיוניים בתא, כמו: מוטציות בדנ"א, טעויות בעיבוד המידע מהחומר הגנטי ועד קבלת החלבון ועוד. תת תיאוריה של תיאוריית כדור השלג היא תיאוריית הרדיקלים החופשיים. 11

תיאוריה זו טוענת כי הפגיעה במקרומולקולות התאיות נובעת מקיום של רדיקלים חופשיים בתא, הנוצרים כתוצאה ממטבוליזם של גורמי חמצון תאיים ]7[. עפ"י תיאוריית הרדיקלים החופשיים, תהליך ההזדקנות תלוי בשיווי המשקל שבין פרואוקסידנטים, הגורמים ליצירת רדיקלים חופשיים, ואנטיאוקסידנטים, המתווכים נטרול של הרדיקלים החופשיים ברקמות הגוף. רדיקלים חופשיים, כגון,)ROS( Reactive Oxygen Species הנוצרים כאשר שיווי המשקל נוטה לעבר מצב יותר חמצוני, המגדיל עקה חמצונית, עלולים,.]8[ בנוסף להאצת תהליך ההזדקנות, גם לעורר תהליכים פרוקרצינוגניים במהלך התהליך הפרוקרצינוגי התא מאבד את הבקרה על חלוקתו, ויחד עם הפגיעה במנגנונים תאיים חיוניים כמו תיקון דנ"א, חלה יצירה של שבט של תאים מותמרים כמוהו אשר גורמים, בסופו של תהליך, ליצירת גידול סרטני. מכאן ששכיחות הופעת גידולים סרטניים עולה עם הגיל. HAT(Histone Acetyltransferase) & HDAC (Histone De-Acetylases) 2.4 מחקרים רבים שפורסמו בעשור האחרון הצביעו על קשר בין תהליכי סרטן והזדקנות לבין,]9,10[ HDAC פעילותם של אנזימי HAT ו- אשר מבקרים את רמות האצטילציה של חלבונים שונים בתא. אצטילציה היא מודיפיקציה כימית קוולנטית, במהלכה מתווספת קבוצת אצטיל )CH3CO( על גבי שיירי ליזין בחלבון. קבוצת אצטיל יכולה להתווסף על חומצה אמינית בקצה האמיני של החלבון, בתהליך המכונה N, acetylation או על ליזין באמצע החלבון, בתהליך המכונה ε. acetylation האצטילציה היא מודיפיקציה המבוצעת לאחר תרגום החלבון ומבקרת מגוון פעילויות תאיות, כמו: מבנה החלבון, תפקוד החלבון ויציבותו, וקביעת מיקומו התוך תאי של החלבון. השפעות אלו נובעות משינוי מטען והפרעות ליצירת קשרי מימן.,)Histone AcetylTransferases( אנזימי HAT כפי שנרמז משמם, מוסיפים קבוצת אצטיל HAT מאצטיל CoA על גבי שיירי ליזין שמורים. בהקשר של היסטונים, אנזימי הם אנזימים המוסיפים קבוצת אצטיל על גבי זנבות ההיסטונים. זנבות ההיסטונים בולטים כלפי חוץ מליבת הנוקלאוזום. זנבות אלו הם לרוב בעלי מטען חיובי, הודות לקבוצות אמין על שיירי ליזין. המטען החיובי מסייע באינטראקציה של הנוקלאוזום עם קבוצות הפוספט הטעונות שלילית המצויות על 12

גבי שרשרת הדנ"א. הוספת קבוצת האצטיל הטעונה שלילית להיסטונים את המטען מנטרלת החיובי על גבי זנבות ההיסטונים, וכתוצאה מכך האמין הופך לאמיד, ישנה ירידה ביכולת מבנה ההיסטון לקשור את הדנ"א ומתאפשרת פתיחה של מבנה הכרומטין שהיה דחוס קודם לכן. פתיחה זו מאפשרת נגישות לגנים על גבי אותו מקטע דנ"א שהשתחרר ]11[, ומאפשרת השתקה או שפעול של גנים. אנזימי ה-,)Histone De-ACetylases( HDAC הם אנזימים הפועלים בצורה הפוכה לאנזימי ה- HAT. אנזימים אלה מבצעים דה-אצטילציה של חלבונים, כלומר הם מסירים קבוצת אצטיל משיירי ליזין מסוימים הנמצאים ברצף החלבון. לפי האמור לעיל, בהקשר של היסטונים, אנזים שהוא HDAC מעודד דחיסה של כרומטין וחוסר נגישות לגנים על גבי הדנ"א. בקרת ביטוי הגנים ע"י אנזימי HAT ו- HDAC יכולה להשפיע על התפתחות תהליך סרטני, שכן אנזימים אלו יכולים, באמצעות דה-אצטילציה, לבקר, בין היתר, גנים הקשורים להתפתחות הגידול הסרטני ממשפחת ה-, oncogenes או גנים הקשורים למניעת התפתחות הגידול הסרטני p53 לדוגמא, פקטור השעתוק מפעיל גנים ספציפיים ממשפחת ה- genes.tumor suppressor HDAC הקשורים לאפופטוזיס ומעגל חלוקת התא דרך היקשרות לדנ"א.,SIRT1 שהוא )כפי שיורחב בהמשך(, מדכא את פעילותו של p53 כפקטור שעתוק על ידי דה-אצטילציה של חלבון זה, וכתוצאה מכך מביא לירידה באפופטוזיס בתגובה לנזק גנומי בתא ]39[. ה- HDAC's מחולקים ל- 4 קבוצות עיקריות: קבוצות 2,1 ו- 4 כוללות אנזימים שאינם תלויים )Nicotinamide Adenine Dinucleotide( ב- NAD+ לשם פעילות הדה-אצטילציה. לעומתם, NAD+ קבוצה 3 כוללת אנזימים ב- התלויים לשם פעילות הדה-אצטילציה. קבוצה זו כוללת משפחה של אנזימים הנקראים סירטואינים, בהם נדון בהמשך. NAD+ רוב מעכבי הדה-אצטילזות הידועים כיום מעכבים את HDAC's ה- שאינם תלויים ב- HDAC's.Sodium Butyrate ו כמו TSA בירור מנגנון העיכוב של חלבוני ה- ע"י,]12,13[ מולקולות שונות יכול להוביל להבחנה וחלוקה של מעכבים פוטנציאליים לפי הקבוצות העיקריות 13

להן החלבונים מחולקים, ומתוך כך להוביל לבחינת השפעתם הביולוגית של המעכבים על התהליכים התאיים בהם משתתפת הקבוצה הרלוונטית של חלבוני ה-.HDAC's 2.5 מעכבים נפוצים של דה-אצטילזות TSA Trichostatin A 2.5.1 מולקולה זו מעכבת את חלבוני ה- HDAC מקבוצות שאינם תלויים ב-,NAD+ אך לא את חלבוני ה- HDAC התלויים ב-.NAD+ בנוסף, מצאו כי מולקולה זו מעכבת את מחזור התא האאוקריוטי ולכן בעלת פוטנציאל אנטי סרטני ]14,15,16[. NAM Nicotinamide 2.5.2 הניקוטין אמיד הוא תוצר הלוואי של פעולת הדה-אצטילציה של חלבוני HDAC התלויים ב-.NAD+ נקלאוטיד זה מהווה נגזרת של הויטמין B3 )ניאצין( ופרקורסור של Nicotinic acid ממנה ייווצר NAD+ חדש. נקלאוטיד זה נמצא כמעכב את פעילות הסירטואינים in vivo ו-.]17[ in vitro 2.5.3 סירטינול - Sirtinol סירטינול היא מולקולה כימית קטנה המעכבת את האנזים Sir2 בעלת ערכי IC50 של 50-70 µm אשר התגלתה בעקבות סריקת ספרייה של 1611 מולקולות שונות ]18[. 2.6 מפעילים נפוצים של דה-אצטילזות Resveratrol 2.6.1 רזברטרול היא מולקולה פוליפנולית אנטיאוקסידנטית המצויה בענבים ויין אדום ]19[. בעבודה שפורסמה בשנת 2113 נמצא כי הרזברטרול מאריך חיים בשמר האפייה ]21[. מולקולה זו היא בעלת מגוון פעילויות המשפיעות על תהליכים שונים בתא, ביניהן עיכוב סינתזת דנ"א ]21[,,]22[ עצירת מחזור התא בשלב S/G2 השריית אפופטוזיס דרך דה-פולריזציה של ממברנת המיטוכונדריה ואקטיבציה של Caspase-9 ]23[ ועוד. 14

במאמר שפרסמו בשנת ]24[, 2111 הראו Khan וחבריו כי טיפול של תאי PC3 עם רזברטרול גרם לירידה במידת השגשוג ועלייה ברמת האפופטוזיס של התאים. האפופטוזיס הושרה באמצעות,Bax Caspase-3 אקטיבציה של החלבונים,Caspase-9 ו- שהינם חלבונים פרו אפופטוטיים, וירידה בפעילות החלבון,Bcl-2 שהוא חלבון אנטי אפופטוטי. SRT-1720 2.6.2 מולקולה בעלת פעילות דומה לזו של רזברטרול אך בעלת רמות פעילות גבוהות פי 1111. נמצאה כמשפרת רגישות לאינסולין, מורידה רמות סוכר בפלזמה של רקמות שומן, כבד ושריר וכן מגבירה פעילות מטבולית ומיטוכונדריאלית ]25[. 2.7 משפחת הסירטואינים Silent Information ( SIRT1-7 Sir2 ביונקים נמצאו שבעה חלבונים הומולוגים ל- השמרי, הסירטואינים הינם חלבונים המבצעים דה-אצטילציה תלוית.)Regulator Two proteins.nad+ בבני אדם קיימים 7 סירטואינים,,SIRT1-SIRT7 אשר דומים באתר הקטליטי השמור אתר תלוי.NAD+ הסירטואינים מתווכים,כאמור, פעילות דה-אצטילציה תלוית :NAD+ תמונה מס' 3: תגובת דה-אצטילציה של החלבון. SIRT1 תמונה מתוך המאמר של Fu et al.]26[ 15

התהליך הקטליטי המתבצע בפעילות הדה-אצטילציה מתרחש בשני שלבים: התקפה של האצטיל-ליזין הגורמת לביקוע של קשר ה NAM -ריבוזיל של מולקולת NAD+ לשם ייצור NAM ותוצר ביניים ADP -ריבוז-פפטידיל..1 2. התקפה של ההידרוקסיד בעמדה שתיים על גבי תוצר הביניים והוספה של מולקולת מים לייצור OAADPr ופפטיד ללא אצטיל ]27[. כאמור לעיל, תהליכי אצטילציה ודה-אצטילציה של היסטונים הן מודיפיקציות המבקרות סגירה ופתיחה של כרומטין, בהתאמה, ובכך משתיקות או משפעלות שעתוק גנים. מכאן שסירטואינים מבקרים ביטוי של גנים במגוון אורגניזמים באמצעות דה-אצטילציה של שיירי ליזין על היסטונים, וכמו כן גם על פקטורי שעתוק וחלבונים נוספים. האב המייסד של משפחת הסירטואינים הוא החלבון השמרי Sir2 Regulator(,)Silent Information אשר זוהה תחילה כפקטור הנחוץ להשתקת שעתוק בשמרים ]28[. החלבון Sir2 משתיק rdna וטלומרים בשמר.Saccharomyces cervisiae מוטציה בחלבון Sir2 מקצרת את אורך חיי החלוקה של השמר ב- 41%, ואילו העלאת פעילות החלבון מאריכה את תוחלת החיים באותם שיעורים. אחת הדרכים אשר הוכחה כמאריכה חיים באורגניזמים שונים היא הגבלת קלוריות.]29[ של כ- 31% מצריכת הקלוריות היומית המומלצת כמו כן, הגבלה )Calorie Restriction(.]31[ קלורית נמצאה כמעכבת מחלות תלויות גיל, כמו סרטן, סוכרת ומחלות נוירודגנרטיביות מוטציה בחלבון Sir2 הקלוריות. השמרי חוסמת את ההשפעה המיטיבה ומאריכת החיים של הגבלת עפ"י ממצאים אלו הציעו החוקרים כי, ביונקים הסירטואינים דרושים לעלייה בתוחלת החיים ועיכוב מחלות תלויות גיל, הנגרמות כתוצאה מההגבלה הקלורית. 16

SIRT1 2.8 החלבון SIRT1 באמצעות כלים ביואינפורמטיים נמצא כי החלבון הוא החלבון עם ההומולוגיה הגבוהה ביותר לחלבון Sir2 השמרי ]31[, והוא גם החלבון הנחקר ביותר. החלבון SIRT1 ההומני מווסת פקטורי שעתוק המבקרים, בין היתר, תהליכים שונים הקשורים senescene למחזור התא, שגשוג, כמו ואפופטוזיס, וזאת ע"י ביצוע תהליך דה-אצטילציה על forkhead p53 מגוון רחב של חלבונים,,Ku70 ביניהם וחלבוני החשובים לעמידות כנגד עקה בתאים. החלבון SIRT1 מבוטא ברקמות שונות. מיקומו העיקרי של החלבון הוא בגרעין, אך ניתן למצוא אותו גם בציטופלסמה. 2.9 סובסטרטים שונים של החלבון SIRT1 שורה ארוכה של מאמרים הראו כי SIRT1 מעלה את עמידות התא למצבי עקה שונים, ובכך מעלה את תוחלת החיים. פעילות זו של החלבון היא הודות לקשירתו לסובסטרטים שונים:,FOXO הוא פקטור שעתוק ממשפחת חלבוני ה- אשר נע בין הגרעין FOXO1 :FOXO1 FOXO לציטופלסמה. משפחת פקטורי השעתוק משרים אפופטוזיס באמצעות בקרה של מספר חלבוני מטרה, כמו: Bim,TRAIL,Fas ligand ו- p27. כאשר החלבון SIRT1 נקשר ומוריד קבוצת אצטיל מפקטור השעתוק FOXO1 הוא מוריד את יכולת השעתוק שלו ]32[. לעומת זאת, כאשר FOXO1 חלבוני הסירטואינים מעוכבים ע"י,nicotinamide פקטור השעתוק אינו מעוכב ע"י החלבון SIRT1 ויכול להיכנס לגרעין ולעבוד שם כפקטור שעתוק ]33[. בנוסף, נמצא כי ישנה רמה גבוהה יותר של חלבוני FOXO פעילים ברקמת ערמונית בריאה לעומת רקמת ערמונית סרטנית, FOXO כלומר ישנה חשיבות לחלבוני כחלבוני בקרה על תהליך האפופטוזיס ברקמת ערמונית FOXO בריאה, בקרה אשר חסרה ברקמת ערמונית סרטנית עקב ירידה ברמות חלבוני ה- הפעילים ]1,34[. 17

:Ku70 דה-אצטילציה של החלבון Ku70 ע"י החלבון SIRT1 מקנה יכולת עמידות לעקה. החלבון Ku70 מעורב בהגנה על טלומרים ובתיקון שברים בדנ"א ]35[. במצב נורמאלי, החלבון Ku70 והחלבון Bax נמצאים יחד כקומפלקס בציטופלסמה. כאשר חל מצב של עקה בתא, מתווספות.PCAF CBP Ku70 שתי קבוצות אצטיל לחלבון ע"י האצטיל טרנספראזות ו- קבוצות האצטיל שהתווספו משחררות את הקומפלקס ומפרידות את החלבון,Bax אשר משרה תהליך אפופטוזיס דרך מעבר למיטוכונדריה. במאמר שפרסם בשנת 2114, הראה ד"ר כהן כי הסרת קבוצת האצטיל מהחלבון Ku70 ע"י החלבון SIRT1 מאקטבת את החלבון Ku70 ומחזקת את קישורו לחלבון,Bax ובכך נמנע מוות תאי בעקבות העקה ]36,37[. החלבון p53, הידוע כ-"שומר הגנום", מהווה את אחד המסלולים העיקריים בבקרת :p53 תהליכים שונים בתא. החלבון p53 משפעל בעיקר גנים ספציפיים הקשורים לאפופטוזיס ומחזור התא דרך קשירה לדנ"א. נזקי דנ"א ואונקוגנים יכולים לשפעל את החלבון p53, ובעקבות כך הוא עובר מודיפיקציות שונות המאפשרות את הצטברותו וייצובו בגרעין. SIRT1 החלבון מעכב את פעילות p53 ע"י דה-אצטילציה ]38[ ובכך מעכב את האפופטוזיס תלוי p53 בתגובה לעקת חמצון ונזקי דנ"א ]39[. 2.10 החלבון SIRT1 וגידולים סרטניים: גורם או מונע? מחקרים שונים קושרים את השפעת החלבון SIRT1 בבקרת שינויים לשינוי בביטוי גנים בתאים סרטניים. אפיגנטיים, אשר גורמים ישנם מחקרים המראים כי עלייה בפעילות החלבון SIRT1 מונעת גידולים: מפעיל סובסטרטים המתקנים נזקי דנ"א, כמו Ku70 וחבריו הראו כי החלבון SIRT1 Cohen.1 ומשפחת חלבוני FOXO אשר מונעים המשך התפתחות תאים לתאים ממאירים ]41, 41[. עליה בפעילות החלבון במודל עכברי לסרטן המעי הפחיתה את התפתחות הגידולים SIRT1.2 ואת התמותה כתוצאה מהם ]39[. 18

מנגד, עיכוב של פעילות החלבון SIRT1 מעלה את האצטילציה של ההיסטונים H4-K16 ו,H3-K9 וכתוצאה מכך ישנה עלייה בביטוי גנים המונעים היווצרות גידולי שד ומעי. בנוסף, החלבון SIRT1 הוא בקר שלילי של תהליך האפופטוזיס התלוי בחלבון p53, כאשר הוא מתווך דה-אצטילציה של החלבון p53 בתגובה לעקה ]39,43[. לדוגמא: בעכברים בהם הושרה ביטוי נמוך של,SIRT1 p53 SIRT1 p53 עבר היפראצטילציה ]44[. ועוכב מכיוון ש- מעוכב, הרי שלחלבון יש גם אפשרות להגביר את הסיכון להתפתחות ]45[. גידולים הנתונים הסותרים אודות פעילותו הסרטנית או האנטי-סרטנית של החלבון SIRT1 מקשים על הסקת מסקנה חד משמעית האם החלבון SIRT1 פועל בתאים בתור אונקוגן או כמעכב גידול ]46,47[. ככל הנראה מדובר במערכת מורכבת התלויה בגורמים רבים, כמו סוג התאים והמיקרו-סביבה בה הם נמצאים. 2.11 החלבון SIRT1 וסרטן הערמונית לפי האמור לעיל, מחלות רבות, וביניהן סרטן, יכולות להיקשר לתהליך ההזדקנות. משפחת הסירטואינים בכלל, והחלבון,SIRT1 בפרט, יכולים להוות בסיס למנגנון התאי המקשר בין הזדקנות ומחלות סרטן שונות. מכיוון שסרטן הערמונית היא מחלה תלוית גיל, הרי שישנה סבירות גבוהה שהחלבון SIRT1 יהיה קשור בהתפתחות הגידול בבלוטת הערמונית, וזו גם הנחת המחקר שלנו. SIRT1 ]1[ Jung-Hynes בשנת 2118 פרסמו וחבריה את בה הראו עבודתם, החלבון כי מבוטא ביתר בצורה משמעותית בתאי PC3 )וכמו כן גם בתאי,LNCaP תאי DU145 תאי )22Rv1, תאי,)P218 P326 PrEC סרטן הערמונית מאדם, תאי לעומת )וכמו כן גם בתאי ותאי תאי אפיתל בריאים מערמונית באדם. )4 ביטוי היתר של SIRT1 התבטא הן ברמת ביטוי החלבון )תמונה מס' ברמת הפעילות והן האנזימתית )תמונה מס' 5(. 19

.PrEC PC3 SIRT1 מס' תמונה 4: ביטוי החלבון גבוה יותר בתאי תאי לעומת תמונה מתוך המאמר של.]1[ Jung-Hynes et al תמונה מס' 5: פעילותו האנזימתית של החלבון SIRT1 גבוהה יותר בתאי PC3 לעומת תאי.PrEC תמונה מתוך המאמר של ]1[. Jung-Hynes et al הפעילות נמדדה בשיטה הפלורוסנטית Flour de Lys המתוארת בפרק שיטות עבודה. 21

על בסיס ממצאים אלו, אנו משערים כי הורדת ביטוי החלבון SIRT1 ועיכוב פעילותו האנזימתית תביא לעצירה בשגשוג של תאי סרטן הערמונית, שניתן יתכן וכך למנוע את התפתחות סרטן הערמונית. במחקר זה, כפי שנתאר בהמשך, נבחן את הפוטנציאל של ארבעה חומרי טבע כמשפיעים על פעילות.SIRT1 האנזים תחילה נבחן את השפעתם של חומרי הטבע ארבעת על פעילות הדה-,SIRT1 אצטילציה in vitro האנזים של ולפי התוצאות נבחר את בחלק זה, חומר הטבע בעל ההשפעה המקסימאלית על פעילות האנזים, ונבחן את השפעתו על רמת הביטוי והפעילות.PC3 האנזימתית של החלבון SIRT1 במודל תרביות תאים של תאי לכל אחד מארבעת חומרי )1,3-diCQA( 1,3-dicaffeate quinic acid,)cc( Cucurbitacin הטבע שנבחן:,NAO ו- )C3R( Cyanidin-3-rhamnoglucoside נמצאו השפעות מעכבות גידולים סרטניים ]48,49,50[. 2.12 מקור חומרי הטבע במחקר זה השתמשנו בארבעה חומרי טבע. עבודות רבות מראות פעילויות מגוונות לחומרי טבע אלו. NAO 2.12.1 ה- )Natural AntiOxidant( NAO הינו אנטיאוקסידנט טבעי מסיס במים הנמצא בעלי תרד. תרד oleracea( )Spinacia הינו צמח השייך למשפחת הסלקיים. תמונה מס' 6: תרד,.Spinacia oleracea (http://www.megadlim.com/files/images) 21

Grossman ה- NAO בודד לראשונה במעבדתו של במהלך סקירה של מעכבי חמצון שומנים ]51,52[. בעבודתה של Bergman וחבריה ]53[ דווח כי הרכיבים העיקריים של התמצית המימית של עלי תרד הם נגזרות של פלבנואידים ושל,p-coumaric acid פלבונואידים. חומצה גלוקורונית של הפלבונואיד הגלוקורוני שבודד מה- NAO הידרוקסיל ו- oxygen ]54[. singlet הראה פעילות בלכידת רדיקלים שונים כמו רדיקל מחקר נוסף שנעשה ב- NAO בדק את השפעת הטיפול ב- NAO על סרטן הערמונית. במחקר זה נמצא כי ה- NAO מקטין באופן משמעותי את נפח הגידולים של סרטן הערמונית בעכברי.SCID בתרביות תאי סרטן הערמונית נמצא כי ה- NAO גורם להאטה במחזור התא ]48[. Cucurbitacin E glucoside 2.12.2 חומר הטבע )CC( Cucurbitacin E glucoside מופק מאבטיח הפקועה.)Cucurbitaaceae( השייך למשפחת הדלועיים,)Citrullus colocynthis (L.) Shard( תמונה מס' :7 אבטיח הפקועה,.Citrullus colocynthis (L.) Shard (http://www.seedman.com/image/d8565.jpg) 22

אבטיח הפקועה מקובל ברחבי המזרח התיכון כצמח מרפא לריפוי ממחלות דרכי השתן, הכבד,]56[ Cucurbitacins וצהבת ]55[. באבטיח הפקועה זוהו מספר חומרים, ה- וביניהם אשר חלקם קשורים לגליקוזידים ]57,58[. ל- Cucurbitacins יש טווח רחב של פעילות ביולוגית בצמחים ובבעלי חיים ]59[, לדוגמא: ו- Cucurbitacin I הינם בעלי פעילות אנטיאוקסידנטית, כאשר הם נבדקו Cucurbitacin B Cucurbitacin B,D,E,I כמעכבי חמצון ]61[. שומנים בנוסף נמצאו כמעכבים ספציפיים של Cucurbitacins האנזים.COX-2 כמו כן, קיימות עבודות המראות פעילות של בעצירת שגשוג תאים סרטניים. Ito וחבריו ]61[ מדווחים על ציטוטוקסיות של Cucurbitacin D/F כנגד מספר שורות תאי סרטן. בעבודה שנעשתה במעבדתו של Grossman דווח על פעילות אנטיאוקסידנטית של ה- Cucurbitacins וכן על פעילות מעכבת של אנזימים ממשפחת ה- COX )ציקלואוקסיגנזות(.]49[ Cucurbitacins ה- glucosides הם תת קבוצה של ה-,Cucurbitacins כאשר לשלד הבסיסי של Grossman ה- Cucurbitacin מחובר סוכר. בעבודה שנעשתה במעבדתו של דווח כי ה-.Cucurbitacins הינם פחות ציטוטוקסיים מאשר ה- Cucurbitacin glucosides עבודה נוספת הראתה כי Cucurbitacin B glucoside ו- Cucurbitacin E glucoside הם בעלי פעילות מעכבת של שגשוג תאי סרטן השד ע"י מנגנון עצירת מחזור התא בשלב ה- G2/M וע"י השראת אפופטוזיס ]49[. Cucurbitacin E Cucurbitacin B glucoside ( Cucurbitacins כמו כן, נבדקה השפעת ה- ו- )glucoside על תאים הומאניים של סרטן הערמונית. כמו בבדיקה שנעשתה על תאי סרטן השד, בעקבות הטיפול ב- נראתה ירידה בהתרבות התאים ועצירה של מחזור התא Cucurbitacins בשלב ה-.G2/M 23

1,3-diCaffeate Quinic Acid 2.12.3 Inula ( (1,3-diCQA) חומר הטבע 1,3-diCaffeate Quinic Acid מופק מהצמח טיון דביק )viscose השייך למשפחת המורכבים. תמונה מס' 8: טיון דביק,.Inula viscose (http://www.wildflowers.co.il/hebrew/plant.asp?id=323) צמח זה ידוע ברפואה העממית כחומר מחטא, אנטי שפעתי, אנטי דלקתי ומוריד חום ]62,63[. לאחרונה נמצא כי מיצוי מימי של טיון דביק מרפא סכרת בחולדות. המיצוי גרם לירידה מהירה ברמת הגלוקוז בדם. לאחר מספר ימים של טיפול נמשכה מגמה זו ללא פגיעה במשקל או ברמות האינסולין בפלזמה ]64[. בעבודתה שנעשתה במעבדתו של Grossman מדווח לראשונה על בידודם ופעילותם האנטיאוקסידנטית של קבוצת החומרים המשתייכים למשפחת (CQA),Caffeoylqunic acid אשר בודדו מהצמח טיון דביק ]65[. הנגזרות השונות של Caffeoylqunic acid ידועים כחומרים המעכבים פרואוקסידציה של חומצות שומן, וכן ידועים במעורבותם בתהליכי הזדקנות מאחר ויש ביכולתם להשפיע על אקטיבציה של מרכיבי מערכת החיסון כדוגמת מונוציטים ]66[. הנגזרות המורכבות מ- 2 מולקולות של (dicqa) Caffeic acid הראו פעילות אנטיאוקסינטית 24 גבוהה כאשר נבחנה יכולתם ללכוד את הרדיקל סופר אוקסיד אניון, בהשוואה לנגזרות בעלות

מולקולה אחת של.(CQA) Caffeic acid בנוסף, נמצא כי פעילותם האנטיאוקסידנטית של נגזרות,DPPH אלו,(diCQA) הנבחנה על ידי יכולת לכידת הרדיקל גבוהה יותר מאנטיאוקסידנטים אחרים כדוגמת α-tocopherol ו-,ascorbic acid הידועים כחומרים בעלי יכולת לכידת רדיקלים גבוהה ]67[. Cyanidin-3-rhamnoglucoside 2.12.4 (C3R) חומר הטבע Cyanidin-3-rhamnoglucoside הוא נגזרת ממשפחת האנטוציאנינים.)Ficus carica L.( הנמצאים בפרי התאנה (anthocyanins) תמונה מס' 9: תאנה,. L.Ficus carica (http://www.ok-ambiente.com/tag/ficus-carica-l/) אנטוציאנינים הם פיגמנטים ברקמות האפידרמיות של פרחים ופירות, להם הם מעניקים צבע.]68[ ורוד, אדום, כחול או סגול עבודות רבות נעשו על נגזרות שונות ממשפחת האנטוציאנינים,]69[ והשפעתן המיטיבה כנגד מחלות תלויות גיל, כמו מחלות קרדיו-וסקולריות השמנה Cyanidin-3- ]74[ Chen וסרטן ]73[. בעבודה של וחבריו דווח כי הנגזרת ]71,71,72[ rhamnoglucoside מורידה את התפשטות ויצירת הגרורות של תאי סרטן ריאה אנושיים. עבודה נוספת שנעשתה עם נגזרת זו הראתה כי צריכה של נגזרת זו משפרת את ראיית הלילה בבני אדם.]75,76[ 25

3. מטרות המחקר המטרה הכללית של עבודה זו היא לבחון את השפעתם של ארבעה חומרי טבע, בעלי פעילות.SIRT1 in vitro אנטיאוקסידנטית, על פעילות הדה-אצטילציה של האנזים עפ"י התוצאות שיתקבלו, יבחר חומר הטבע בעל ההשפעה המקסימאלית על פעילות הדה-אצטילציה in vitro של האנזים,SIRT1 ותיבדק השפעתו על רמת הביטוי והפעילות של החלבון במודל תרביות תאים של תאי סרטן הערמונית באדם. המטרות הספציפיות של המחקר הן: 1. הפקה וניקוי של חומרי הטבע..SIRT1 in vitro בחינת חומרי הטבע השפעת על פעילות דה-אצטילציה החלבון של עפ"י.2 התוצאות בחלק זה יבחר חומר הטבע, בעל ההשפעה המקסימאלית על פעילותו של האנזים,SIRT1 להמשך המחקר. 3. הערכת היכולת של חומר הטבע הנבחר למנוע את התפתחות סרטן הערמונית במודל של תאי סרטן ערמונית מאדם. 4. בדיקת מעורבותו של החלבון SIRT1 במנגנון פעולתו של חומר הטבע הנבחר במערכת התאית של סרטן הערמונית: א. בדיקת יכולתו של חומר הטבע הנבחר להשפיע על רמת הביטוי של החלבון.SIRT1 ב. בדיקת יכולתו של חומר הטבע הנבחר להשפיע על פעילותו האנזימתית של החלבון.SIRT1 26

חשיבות המחקר שכיחות סרטן הערמונית נמצאת בסימן עלייה בשנים האחרונות. סרטן הערמונית הינו גידול תלוי.4.]4,5[ 41 גיל, כאשר בגברים מעל גיל שכיחותו הולכת ועולה עם הגיל מכיוון שישנה עלייה בתוחלת החיים, צפוי כי מספר המקרים של סרטן הערמונית יעלה בשנים הבאות, ומכאן שישנה חשיבות להבין את המנגנון והקשר המולקולארי בין תהליך ההזדקנות להתפתחות סרטן SIRT1 הערמונית. אחד החלבונים שנמצא כי מבוטא ביתר בתאי סרטן הערמונית הוא החלבון לפיכך ויסות רמת ביטויו ופעילותו הינה בעלת חשיבות רבה לטיפול בסרטן הערמונית.,]44[ חומרי הטבע שיבחנו: ו- C3R 1,3-diCQA נמצאים כבעלי,Cucurbitacin E glucosides,nao פוטנציאל אנטי סרטני הבנת מנגנון הפעולה של חומר הטבע הנבחר במניעת.]48,49,50[ התפתחות סרטן הערמונית ותפקידו של החלבון SIRT1 בפעילות זו עשויים לתרום לפיתוח אמצעים פרמקולוגיים חדשים להתערבות בסרטן זה. 27

שם החומר ABTS 30% acryl-bisacrylamide mix Ammonium Persulphat (APS) Ampicillin Bacto Tryptone Bacto Yeast Extract BD TALON Resin β -mercapto ethanol Bovine serum albumin(bsa) Bradford reagent Bromophenol blue DharmaFECT1 DMEM without phenol-red DMSO DnaseI ECL Ethanol FCS Filter (0.2µm sterile) Flour de Lys-SIRT1 Deacetylase Substrate Glycerol Glycine Glutamine (L) HCl Imidazol KCl Methanol MgCl2 NaCl NP-40 Pen-Strep Phosphate buffer saline(pbs) Protease Inhibitor cocktail tablets SDS Seeband Skim milk powder Temed חומרים ושיטות עבודה 5.1 חומרים 5.1.1 כללי החברה המספקת Sigma BioRad Merck Sigma Bio-lab Bio-lab Clontech Sigma Sigma BioRad Sigma ThermoSCIENTIFIC Biological industries Sigma Roche Pierce Frutarum Biological industries Yarden Biomol Frutarum Sigma Biological industries Bio-lab Sigma Bio-Lab Frutarum Fluka Bio-Lab Fluka Biological industries Biological industries Roche Sigma Geba Fluka Bio-Rad.5 28

שם החומר Tris Base Tris HCl Trolox Trypsin-EDTA solution Tween-20 החברה המספקת Sigma Sigma Acros Biological industries BioRad מרקרים החברה המספקת שם המרקר 5.1.2 Precision Plus Protein Standard Dual Color BioRad ערכות החברה המספקת שם הערכה 5.1.3 Cell Proliferation Kit (XTT based) CENTRIPREP Biological industries AMICON 5.1.4 רשימת נוגדנים ומיהול באנליזת Western Blot מיהול 1:500 1:2000 1:1000 1:1000 1:10,000 1:10,000 יצרן ומספר קטלוגי Haim Cohen Santa Cruz, sc-47778 Santa Cruz, sc-126 Cell signaling, CS#2525 Jackson, 111-035-003 Jackson, 115-035-174 מקור Rabbit Mouse Mouse Rabbit Goat Goat שם הנוגדן SIRT1 β-actin HRP conjugated p53 Acetyl-p53 (Lys 382) Rabbit HRP conjugated Mouse HRP conjugated Lysis buffer 5.1.5 להפקת חלבונים Tris, ph = 8, 0.05M.1 NP-40, 1%.2 NaCl, 0.15 M.3 MgCl2, 0.001M.4 Glycerol, 10%.5 6. לכל 11 מ"ל של בופר ליזיס הוסף טבליה אחת של מעכב פרוטאזות. מיצוי חלבונים מתאים בוצע באמצעות בופר זה. 29

5.1.6 בופר העמסת חלבונים (Sample buffer) X5 Tris, ph = 6.8, 0.125M.1 SDS, 2%.2 Bromophenol blue, 0.005%.3 Glycerol, 20%.4 β-marcapto ethanol, 0.5%.5 6. מים מזוקקים עד לנפח של 10 ml בופר זה נמהל פי 5 עם אקסטרקט חלבוני והוטען על ג'ל פוליאקרילאמיד. 5.1.7 מרכיבים עבור resolving gel בריכוז (5ml) 10% H 2 O, 1.9 ml.1 30% acryl-bisacrylamide mix, 1.7 ml.2 Tris, ph = 8.8, 1.5M, 1.3 ml.3 10% SDS, 0.05 ml.4 10% APS, 0.05 ml.5 TEMED, 0.002 ml.6 5.1.8 מרכיבים עבור stacking gel בריכוז (4ml) 5% H 2 O, 2.7 ml.1 30% acryl-bisacrylamide mix, 0.67 ml.2 Tris, ph = 6.8, 1.5M, 0.5 ml.3 10% SDS, 0.04 ml.4 10% APS, 0.04 ml.5 TEMED, 0.004 ml.6 31

5.1.9 בופר הרצה לחלבונים (Running Buffer) X10 SDS 10%, 100 ml Tris, 30.3 gr Glycine, 144.1 gr השלמה לנפח של 1 ליטר ע"י הוספת.H2O.1.2.3.4 בופר זה נמהל פי 11 ובו התבצע תהליך הפרדת החלבונים על גבי מתקן מתאים של חברת.Bio-Rad 5.1.10 בופר העברת חלבונים (Transfer buffer) X10 Tris, 30.285 gr Glycine, 144.1 gr השלמה לנפח של 1 ליטר ע"י הוספת.H2O.1.2.3 5.1.11 בופר העברת חלבונים (Transfer buffer) X1 Transfer buffer X10, 100 ml Methanol, 200 ml H20, 700 ml.1.2.3 בופר העברת חלבונים X1 שימש להעברת חלבונים מג'ל פוליאקרילאמיד לממברנת ניטרוצליולוז. מתקן ההעברה שייך לחברת.Bio-Rad 5.1.12 תמיסת חלב 5% המסת 5 גרם (Fluka) Skim milk powder לתוך 100 ml בופר.TBST X1 תמיסה זו שימשה לביצוע blocking של הממברנה לפני הגבתה עם הנוגדן הראשוני ולמיהול של הנוגדנים הראשונים והנוגדנים השניוניים. 31

5.1.13 בופר TBST X1 Tris, ph = 7.4, 1M, 50 ml Tween-20, 1 ml NaCl, 5M, 30 ml השלמה לנפח של 1 ליטר ע"י הוספת.H2O.1.2.3.4 בופר זה שימש לשטיפת הממברנה לאחר הגבתה עם נוגדן ראשוני ולאחר הגבתה עם נוגדן שניוני. LB 5.1.14 נוזלי Bacto Tryptone, 10 gr NaCl, 10 gr Bacto Yeast Extract, 5 gr השלמה עם H2O לנפח של 1 ליטר ועיקור באוטוקלאב..1.2.3.4 Ampicillin 5.1.15 וריכוזי עבודה ריכוז עבודה סופי לברירת חיידקים בעלי עמידות לאנטיביוטיקה זו הוא 100. µg/ml 5.1.16 בופר שטיפה (בופר A) Tris, ph = 7/8, 20 mm NaCl, 200 mm השלמה עם H2O לנפח הרצוי..1.2.3 שימוש בבופר זה מתואר בסעיף 5.2.5.1. 32

5.1.17 בופר הטענה (בופר B) Tris, ph = 7/8, 20 mm NaCl, 300 mm Imidazol, 10 mm השלמה עם H2O לנפח הרצוי..1.2.3.4 שימוש בבופר זה מתואר בסעיף 5.2.5.1. 5.1.18 בופר אלוציה (בופר C) Tris, ph = 7/8, 20 mm NaCl, 300 mm Imidazol, 200 mm השלמה עם H2O לנפח הרצוי..1.2.3.4 שימוש בבופר זה מתואר בסעיף 5.2.5.1. 5.1.19 בופר אחסון 25mM Tris ph = 7.5, 100 mm NaCl, 5mM DTT, 10% glycerol שימוש בבופר זה מתואר בסעיף 5.2.5.2. 5.1.20 בופר ריאקציה למבחן Flour de Lys 50 mm Tris/HCl ph = 8; 137 mm NaCl; 2.7 mm KCl; 1mM MgCl2; 1 mg/ml BSA שימוש בבופר זה מתואר בסעיף 5.2.6. 33

5.2 שיטות עבודה 5.2.1 בידוד וזיהוי חומרי הטבע 5.2.1.1 הפקת NAO מעלי תרד 1:1 לצורך הפקת,NAO נלקחו עלי תרד ונכתשו במים ביחס של בין מסת העלים לנפח המים. לאחר מכן בוצע סינון לסילוק פסולת העלים וסרכוז לסילוק שברי תאים, והנוזל העליון נודף מ- 3% ל- 15% באוואפורטור C).(80 0-90 0 בכדי לרכז את החומר הועבר החומר המוצק דרך ממברנה של אולטרה פילטריישן.3K-pore-size החומר המסונן הועבר לייבוש בהקפאה לקבלת אבקה של.NAO תמיסת ה- NAO רוכזה ל- 25% על ידי אידוי ב- 80. 0 C מתמיסה זו נלקחה דגימה של 1 ml ועורבבה במשך 5 דקות עם 9 ml אצטון. תערובת זו סורכזה במהירות של 20000xg.85 0 C למשך 11 דקות. הנוזל העליון נאסף והאצטון אודה ב- להפקת נגזרות הפלבונואידים ונגזרת החומצה הקומרית נלקח התוצר הסופי לאנליזה והפרדה ב- HPLC כפי שמתואר בעבודתה של Bergman וחבריה ]53[. 5.2.1.2 הפקת החומר Cucurbitacin E glucosides מהפרי של אבטיח הפקועה הפירות של אבטיח הפקועה נאספו בשדה גידול באוניברסיטת בר-אילן. הפירות נשקלו, נחתכו והוצאה הליבה של הפירות. ליבת הפירות יובשה בליופיליזר (48 C- 0.07) mbar, למשך לילה. לאחר הייבוש, הפירות נטחנו לקבלת אבקה. לאחר מכן נעשה מיצוי בכלורופורם : מתנול )1:9(.CC (Citrullus colocynthis) למשך לילה. האבקה שעברה מיצוי סוננה. המיצוי נקרא מיצוי ה- CC עבר סיפוח לקולונה. נלקחו 2ml מהמיצוי והומסו ב- EtOAc לקבלת נפח סופי של.4ml החומר שהומס סופח לקולונת (0.040-0.063nm),silica gel 60 ועל הקולונה הוטענה כמות של כ- 1gr חומר. תנאי הקולונה שבוצעה: שטיפה ראשונה של הקולונה נעשתה עם אטילאצטאט. לאחר הטענת הדוגמה על הקולונה בוצעה שטיפה עם EtOAc 300-400ml ולאחר מכן אילוציה 11:11:95 בהתאמה. 511 עם ml תערובת ממסים כלורופורם:מתנול:אטילאצטאט ביחס של 34

נאספו מספר פרקציות ועל ידי בדיקה ב- NMR נמצא כי התקבלה הפרדה בין,Cucurbitacin E שמשקלו כ-,150mg לשאר הפרקציות. 5.2.1.3 הפקת החומר 1,3-dicaffeate quinic acid מהעלים של טיון דביק הצמח טיון דביק נקטף כ- 21 ס"מ מהקודקוד. עליו הופרדו, נשקלו והוספו להם מים ביחס 1:4 ממשקלם. החומר סונן וסורכז ב- 12,000Xg למשך 11 דקות. הנוזל העליון הורתח למשך כ- 40 דקות לאידוי המים ב- 70 C ויובש בליופילייזר -48 C) 0.07) mbar,. החומר היבש עבר תהליכי הפרדה לקבוצות על ידי מיצויים שונים: בתחילה על ידי אצטונטריל להוצאת החומרים ההידרופוביים יותר, ולאחר מכן המשקע שנותר עבר מיצוי במתנול. במיצוי המתנולי היו חומרים הידרופיליים, ובהם חומר הטבע אשר שימש אותנו לעבודה זו. לאחר מכן בוצעה כרומטוגרפית שכבות דקות (TLC) על לוחות אלומיניום מצופים סיליקה-ג'ל התמיסה בה בוצעה הפרדת הפרקציות הכילה בוטנול,.(silica gel 60 F254 plates, Merck) 1 :4 :6 חומצה אצטית ומים מזוקקים ביחס של בהתאמה. הפרקציות השונות גורדו, נאספו 1:3 מהפלטה ועברו מיצוי ע"י מתנול:מים ביחס של בהתאמה. לאחר מכן הושקעו גרגרי הסיליקה ע"י סרכוז ב- 17,212Xg למשך 11 דקות. הנוזל העליון עבר יבוש בלויפילייזר. בהמשך הופרדו החומרים ע"י HPLC לכל הנגזרות. 5.2.1.4 רכישת חומרי הטבע Resveratrol ו- (C3R) Cyanidin-3-Rhamnoglucoside חומר הטבע נרכש מחברת וחומר הטבע C3R נרכש מחברת Sigma Resveratrol.Apin Chemicals 35

5.2.2 הפרדת NAO מעלי התרד, מיצוי מתנולי מטיון דביק ומיצוי ה- CC מאבטיח הפקועה על גבי HPLC ההפרדה נעשתה על ידי (HPLC) High pressure liquid chromatography מתוצרת Lachrom (Merck-Hitachi) תוך שימוש בתוכנה: 7000-D. HSM ההפרדה ע"ג ה- HPLC נעשתה בקולונה.250nm הכרומטוגרמה נקבעה באורך גל של.(Reverse Phase) RP8 5.2.3 זיהוי המבנה המולקולארי ע"י שימוש ב- NMR 10% N.M.R פענוח המבנים שבודדנו נעשה באמצעות ספקטרה תמ"ג- שנמדד בתערובת של Bruker DMX-600 TMS 0.1% ו- CDCl 3 90% המכילה והורץ במכשיר CD 3 OD ב- ( 1 H) 600.1 MHz ו- MHz ( 13 C) 150.9 בטמפרטורת החדר. 5.2.4 מדידת הפעילות האנטיאוקסידנטית של חומרי הטבע ע"י שימוש ב- assay ABTS + בשיטה זו נמדדת סך כל הפעילות האנטיאוקסידנטית של המולקולה. השיטה מבוססת על היכולת של אנטיאוקסידנטים ללכוד את הרדיקל קטיון +,ABTS הנוצר כתוצאה מחמצון של (2,2'-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)) ABTS על ידי פוטסיום פרסולפט ) 8 K) 2 S 2 O ]77[. בשיטה זו הפעילות האנטיאוקסידנטית מוצגת בהשוואה ל-,Trolox אנלוג מסיס במים של ויטמין ]77[. E מהלך הבדיקה: 5ml מתמיסת (7mM) ABTS ו- 88µl של פוטסיום פרסולפט (140mM) עורבבו. התמיסה נשמרה בטמפרטורת החדר למשך 12 שעות בחושך. לצורך הניסוי, התמיסה נמהלה עם אתנול עד לקבלת בליעה של O.D. ± 0.02 0.7 ב-,734nm אשר נקבעה בספקטרופוטומטר. הדוגמאות בריכוזים השונים )בנפח של )50µl הוטענו בפלטה של 96 בארות, והוספו להן 200µl מתמיסת ה- ABTS המהולה. הפלטה נקראה בספקטרופוטומטר באורך גל של.734nm התוצאות חושבו ביחס לעקומת סטנדרט של 5 10). 4- (M Trolox 36

5.2.5 הפקת חלבון SIRT1 רקומביננטי 5.2.5.1 הפקת חלבון SIRT1 רקומביננטי מסומן ב- tag X6 His מחיידקי E.coli גידול תרבית חיידקי BL21 המכילים פלסמיד ביטוי חלבון רקומביננטי מתויג ב- 25 מ"ל LB בתוספת אמפיצילין בריכוז של 100, µg/ml למשך הלילה ב- 37. o c הרחפת התרבית ב- 1 ליטר.OD 600 = 0.6-0.8 100 µg/ml מדיום,LB הוספת בריכוז של אמפיצילין והדגרה עד ל- 3 אינדוקציית ביטוי ע"י IPTG 1mM והדגרה למשך כ- שעות נוספות. השקעת התאים ע"י 21 דקות ב- c 4 o צנטריפוגציה ב- 3140rpm למשך והרחקת הנוזל העליון. הרחפת משקע התאים ב- 21 מ"ל בופר A. חלוקת התרחיף ל- 4 פלקונים של 15 מ"ל, בכל אחד 5 מ"ל תרחיף. 4 MgCl 2 31 סוניקציות של 15 שניות בקרח עם הפסקה של שניות בין כל סוניקציה. הוספת 10mM ו- DnaseI 40U והדגרה למשך 31 דקות בקרח. צנטריפוגציה ב- 12,000xg למשך 21 דקות ב-.4 o c העברת הנוזל העליון, שהוא מיצוי החלבונים הכללי, ללא שאריות משקע, BD TALON למבחנה חדשה והוספת טבלייה של.Protease inhibitor הרחפת כדוריות Resin והעברת 2 מ"ל לפלקון 51 מ"ל. שטיפה עם בופר A וצנטריפוגציה ב- 800xg למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר. סילוק נוזל עליון וחזרה על שלב זה. הוספת מיצוי החלבונים הכללי 31 ל-.BD TALON Resin נענוע עדין בטמפרטורת החדר למשך דקות. צנטריפוגציה ב- B 21 למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר וסילוק נוזל עליון. הוספת מ"ל בופר 800xg ונענוע עדין למשך 11 דקות בטמפרטורת החדר שלאחריו צנטריפוגציה ב- 800xg למשך 5 דקות B 2 בטמפרטורת החדר. חזרה על שלב זה. מ"ל בופר הוספת למשקע וערבוב ע"י וורטקס. העברת התרחיף ל- gravity flow column עם פקק והמתנה לשקיעת הכדוריות בקולונה. הסרת הפקק והמתנה עד שהבופר מתנקז לגובה הכדוריות. שטיפה עם 11 מ"ל בופר B. אילוציה בעזרת 8 מ"ל בופר C ואיסוף פרקציות של 1 מ"ל. בשלב זה ניתן לחלק לפרקציות קטנות יותר ולאחסן ב- 80- o c או להמשיך לניקוי מאימידזול. 37

5.2.5.2 ניקוי חלבון רקומביננטי מאימידזול CENTRIPREP ניקוי החלבון SIRT1 הרקומביננטי מאימידזול נעשה בעזרת מבחנת של,cut off size = 3 KDa חברת AMICON בעלת בכדי לקבל הפרדה באמצעות סרכוז בין החלבון SIRT1 הגדול מ- 3 KDa לבין האימידזול, הקטן מ- 3. KDa מבחנת ה- Centricon נשטפה עם 5 מ"ל בופר אחסון וסורכזה במהירות 5,000xg למשך 21 דקות. לאחר סרכוז זה הוטענו 2 מ"ל של פרקציות חלבון רקומביננטי בעלות הריכוז הגבוה ביותר שהתקבלו בהפקת החלבון 0.1ug/ul( ומעלה( יחד עם 3 מ"ל בופר אחסון והופרדו מהאימידזול באמצעות סרכוז 21 במהירות 5,000xg למשך דקות. חלוקת הנוזל שמעל הממברנה )חלבון, ללא אימידזול, 1 מומס בבופר האחסון( לפרקציות של מ"ל. ריכוז הפרקציות חושב בעזרת מכשיר הננודרופ. להמשך העבודה נלקחו פרקציות שריכוזן 0.1ug/ul ומעלה. חלוקת הפרקציות הרלוונטיות להמשך העבודה לפרקציות של 100ul והקפאה ב- 80-. o c 5.2.6 מבחן פלורוסנטי לפעילות דה-אצטילציה Assay) (Flour de Lys מבחן Flour de Lys הוא מבחן המודד פעילות דה-אצטילציה.In vitro זהו מבחן פלורוסנטי אשר נועד למדוד את היכולת של חלבונים לתפקד כדה-אצטילזות, דהיינו להסיר קבוצת אצטיל משייר ליזין. המערכת בה נעשה שימוש בעבודה זו כוללת חלבון SIRT1 רקומביננטי, סובסטרט שהוא ליזין שמחוברת למולקולה פלורוסנטית, ואת הקו-סובסטראט,.NAD+ בשלב הראשון האנזים מבצע דה-אצטילציה על הפפטיד הקצר המכיל ליזין אצטיל. רק לאחר הרחקת האצטיל מהליזין, הפפטיד יכול להיחתך ע"י טריפסין )תמיסת,)DEVELOPER כך שנוצרת מולקולת פלואורופור אשר ניתן לעורר אותה באורך גל של,360nm ולמדוד את הפלורסנציה הנפלטת ע"י קריאה באורך גל של,460nm כלומר רמת הפלורוסנציה נמצאת ביחס ישר לכמות הדה אצטילציה שביצע האנזים. 38

ה, תמונה מס' 10: סכמה של הריאקציה הפלורוסנטית לבדיקת פעילות הדה-אצטילאז.SIRT1 הסכמה מתוך הפרוטוקול של חברת SIRT1 Fluorimetric Drug Discovery Kit :BIOMOL.(BML-AK555) הניסוי נערך עפ"י הפרוטוקול של חברת ]21[. BIOMOL מבחן הדה-אצטילציה נבדק בפלטת 96 באריות. את התמיסות )פרט ל- 1 µg,)developer של האנזים וחומרי הטבע בריכוזים השונים, המומסים בבופר הריאקציה, מכניסים לתוך בארית בנפחים המתאימים לפי הריכוזים הנבדקים. השלמת נפח הריאקציה ל- 50 µl נעשית ע"י בופר הריאקציה. האנזים מוסף אחרון. לאחר מכן מתבצעת הדגרה בחושך ב- 37 C למשך שעה. לאחר מכן הוספת 50 µl של תמיסת Developer והדגרה 21 דקות בטמפרטורת החדר. האקסיטציה נעשית באורך גל של 360nm קריאה באורך Microplate Fluorescence גל של.460nm קריאת הפלואורסנציה נעשית במכשיר ה-.THERMO-LABSYSTEMS של חברת Reader הכנת מרכיבי הריאקציה: בופר הריאקציה הרכב הבופר מופיע בסעיף 5.1.20 500. µm שנמהל בבופר הריאקציה לריכוז סופי בבארית של 50mM סטוק של :NAD+ סובסטרט: סטוק של 50 mm שנמהל בבופר הריאקציה לריכוז סופי בבארית של.250µM.1.2.3 39

4. אנזים: עפ"י ריכוז האנזים הרקומביננטי שהופק, לוקחים נפח כך שבכל ריאקציה משתמשים Developer X 20 שנמהל פי 21 בבופר הריאקציה. ב- 1 µg אנזים..5 תמיסת :Developer American Type Culture Collection 5.2.7 תרביות תאים תאי,PC3 תאי סרטן ערמונית מאדם, נרכשו מחברת )ATCC( וגודלו במדיום מסוג )RPMI1640( Roswell Park Memorial Institute עם גלוטמין אשר.Trypsin.Pen/Strep FCS הוסף לו 11% ו- 1% התאים נותקו מהצלחת בעזרת מדיום המכיל התאים סורכזו במהירות של,RPM 1511 הורחפו במדיום גידול ופוצלו למספר צלחות רצוי. התאים הוקפאו ב- FCS ו-.DMSO 11% בכל שלב נכחו התאים באינקובאטור המווסת ל- 5% 37 C. ו 95% אוויר ובטמפרטורה של CO2 5.2.8 בדיקת שגשוג של תאים (שיטת (XTT השפעת ה- NAO על שגשוג התאים נמדדה בעזרת הריאגנט.XTT מלחי טטרזוליום עוברים ביקוע בנוכחות דה-הידרוגנאזות למולקולה אשר בולעת ב.450nm הטטרזוליום עובר ביקוע רק בתוך מיטוכונדריות פעילות, לכן הריאקציה מתרחשת רק בתאים חיים, לכן שיטה זו טובה לבדיקת שגשוג של תאים ]78[. מהלך הבדיקה: NAO נזרעו לבארות בפלטה של 96 בארות. לאחר 24 שעות הוחלף המדיום, וה- תאי PC3 5 10 3 בריכוזים שונים הוסף לבאריות. לאחר שעבר פרק הזמן הרלוונטי )24, 48 או 72 שעות( הוחלף המדיום והוסף 25µl ריאגנט XTT למשך 4 שעות. הבליעה נקראה באורך גל של.450nm 41

5.2.9 חלבונים 5.2.9.1 הפקת חלבונים מתאים אנימליים.91% גידול תאים עד לקונפלואנטיות של כ- קילוף התאים עם טריפסין. סרכוז התאים ב- 1,500 RPM למשך 5 דקות. שאיבת הנוזל והרחפת הפלט עם בופר ליזיס. לאחר מכן אינקובציה של התאים המורחפים למשך חצי שעה בקרח. סרכוז התאים ב- 14,000 RPM למשך 20 דקות, והעברת הנוזל העליון, שמכיל את כלל חלבוני התא, למבחנת אפנדורף חדשה. 5.2.9.2 קביעת ריכוז חלבון קריאת ריכוז חלבון באמצעות תמיסת ברדפורד )21% ברדפורד, 81% מים(. קריאת הריכוז נעשתה ע"י ערבוב של 1 µl דגימה בתוך 999 µl תמיסת ברדפורד בתוך קיווטת פלסטיק. הקריאה נעשתה בספקטרופוטומטר באורך גל של 595. nm על מנת למצוא את הריכוז במספרים אבסלוטים הוכנה עקומת כיול בריכוזים ידועים מהחלבון.BSA Western blot analysis 5.2.9.3 Sample Buffer.11% מיקרוגרם של חלבון הופרדו על גבי ג'ל פוליאקרילאמיד הוספת 31 לדוגמאות והרתחה לכ- 5 דקות. הדוגמאות הדנטורטיביות הוטענו על גבי הג'ל והורצו עם תמיסת החלבונים המבוקשים זוהו בעזרת Precision Plus Protein המרקר.running buffer X 1.Standard Dual Color החלבונים על גבי הג'ל הועברו לממברנת.Nitrocellulose ההעברה נעשתה בשיטת הטרנספר הרטוב ב- 250mA למשך שעתיים. הממברנה הושרתה בנוכחות Skim milk 5% powder המומס בבופר,TBST למשך שעה. אינקובציה של הממברנה בנוכחות נוגדן ראשוני אשר.4 C TBST Skim milk powder נמהל ב- 5% המומס בבופר למשך הלילה, בטמפרטורה של המיהול נקבע על פי הוראות היצרן. הממברנה נשטפה 3 פעמים בתמיסת TBST למשך 11 דקות 1:10,000 בתמיסת 5% בכל פעם. אינקובציה של הממברנה בנוכחות נוגדן שניוני במיהול של 41

ש, 11 TBST הממברנה נשטפה 3 פעמים בתמיסת למשך דקות בכל פעם..Skim milk powder הממברנה נחשפה לסובסטרט (ECL) enhanced chemiluminescent למשך דקה בחושך. חשיפת הממברנה בחדר חושך ופיתוח. כימות הבנדים שהתקבלו נעשה בעזרת תוכנת.ImageJ 5.2.9.4 צביעת חלבונים ב Coomassie Brilliant Dyes על גבי ג'ל פוליאקרילאמיד 15 חלבונים הופרדו על גבי ג'ל פוליאקרילאמיד בדיוק כמו בסעיף 4.2.9.3. נשטף הג'ל דקות במים. המים נשאבו והוסף ריאגנט Seeband של חברת,Geba עד להופעת בנדים מתאימים. הצבע נשאב ואילו הג'ל עבר טלטול עדין במים ל 15 דקות נוספות. הג'ל צולם במצלמה דיגיטלית לצורך ניתוח התוצאות. DharmaFECT1 5.2.10 השתקת החלבון SIRT1 באמצעות sirna החדרת מקטעי דנ"א לתאים אנמליים בוצעה בעזרת ריאגנט טרנספקציה המיוצר על ידי חברת ThermoSCIENTIFIC בארה"ב ועל פי פרוטוקול היצרן. 4 10 5 תאי PC3 נזרעו בפלטה של 6 בארות. לאחר 24 שעות הוחלף המדיום. עבור כל בארית בה בוצעה השתקה של החלבון SIRT1 הוכנו 2 התערובות הבאות: תערובת אחת המורכבת מ- 100 µl של מדיום RPMI ללא תוספת 10% FCS ו- 1% Pen/Strep עורבבו עם 100 µl של sirna כנגד SIRT1 בריכוז 2. µm התערובת השנייה המורכבת מ- 194µl של מדיום RPMI ללא תוספת 10% FCS ו- 1% Pen/Strep עם 6 µl ריאגנט טרנספקציה. כל תערובת עורבבה למשך 5 דקות במנדף 21 2 ולאחר מכן ביולוגי, תערובות אלו עורבבו יחד למשך דקות במנדף ביולוגי. לאחר מכן טופטפה התערובת על התאים בבארית. 24 שעות לאחר תחילת הטרנספקציה הוחלף המדיום. 72 NAO שעות לאחר תחילת הטרנספקציה נקצרו התאים. עבור כל ריכוז של בו בוצע השתקת sirna החלבון SIRT1 לפני כן, בוצעה גם השתקת ביקורת באמצעות ביקורת, שימוש תוך בפרוטוקול זהה לפרוטוקול של sirna כנגד.SIRT1 ה- sirna כנגד SIRT1 וה- sirna ביקורת נרכשו מחברת.Sigma 42

רצף ה- sirna כנגד :SIRT1 גדיל ה- 5'-GAA GUA CAA ACU UCU AGG A dtdt-3' :sense גדיל ה- 5'-UCC UAG AAG UUU GUA CUU C dtdt-3':anti-sense 5.2.11 ניתוח סטטיסטי של התוצאות התוצאות של הניסויים המוצגות בעבודה זו הן ממוצע ± סטיית תקן. העיבודים הסטטיסטיים נעשו לפי,Student's t-test כאשר הבדל מובהק סטטיסטית הוא < 0.05 p לפחות. 43

תוצאות 6.1 הפרדת חומרי הטבע 6.1.1 הפקת NAO מעלי תרד ובידוד הפוליפנולים Flavonoid glucoside ו- acid p-coumaric במיצוי המימי של NAO נמצאו נגזרות של פלבונואידים ו- p-coumaric acid מהפרקציה.6.NAO ההידרופובית. נגזרות אלו מהוות את המרכיבים העיקריים של ה- לצורך הפקת נגזרות הפלבנואידים ונגזרות החומצה הקומרית מתערובת ה-,NAO נלקח התוצר הסופי לאנליזה, הפרדה ב- HPLC וזיהוי ב- NMR כפי שמתואר בעבודתה של Bergman וחבריה ]53[. μl 100 מה- RP8 הוטענו על HPLC והופרדו על גבי קולונת כמתואר בפרק שיטות העבודה. שיטות NAO הפרדה וניקוי אלו אפשרו להגיע לדרגת ניקיון מקסימלית של המרכיבים העיקריים - הפלבונואידים, במיצוי המימי של ה-.NAO הפרקציות שנאספו נבדקו במכשיר ה- NMR. gr/mole )A( הנגזרות שהתקבלו הן: Flavonoid glucoside אשר משקלה המולקולארי הוא 536.45 ו- )B( p-coumaric acid אשר משקלה המולקולארי הוא.338.27 gr/mole.a.b תמונה מס' 11:.Flavonoid glucoside המבנה הכימי של נגזרת ה- A:. p-coumaric acid המבנה הכימי של נגזרת ה- B: 44

6.1.2 הפקת Cucurbitacin E glucosides מהפרי של אבטיח הפקועה לצורך הפקת חומר הטבע מהפרי של אבטיח הפקועה, נעשה מיצוי מתנול: כלורופורם של הפרי, כמתואר בפרק שיטות עבודה. התקבלה אבקה אשר הומסה באתיל-אצטט. האבקה המומסת נקראת 65 µl.cc מה- CC הוטענו על גבי HPLC והופרדו על גבי קולונת.RP8 לפי אנליזה שבוצעה בעזרת ה-,NMR הפרקציה הפעילה הכילה תערובת של.Cucurbitacins על מנת להפריד בין Cucurbitacin E glucosides לשאר החומרים, ה- CC סופח לקולונת silica Cucurbitacin E glucosides כמתואר בפרק שיטות העבודה. התקבל אשר משקלו,gel המולקולארי הוא 737. gr/mole מבנה החומר פוענח על ידי שימוש ב-.NMR תמונה מס' 12: המבנה הכימי של חומר הטבע.Cucurbitacin E glucosides 6.1.3 הפקת 1,3-dicaffeoylquinic acid מעלי טיון דביק לצורך הפקת חומר הטבע מעלי טיון דביק, נערך מיצוי מימי של עלי טיון דביק, כמתואר בפרק שיטות עבודה. המיצוי עבר הומוגניזציה, סינון וסרכוז. הנוזל העליון הורתח ועבר ייבוש בליופיליזר לקבלת אבקה. אבקת הטיון דביק הורחפה באצטוניטריל במטרה למצות את החומרים ההידרופוביים יחסית. המשקע הנותר לאחר המיצוי באצטוניטריל הורחף במתנול, וזאת במטרה להפריד חומרים הידרופיליים בעלי פעילות אנטיאוקסידנטית. בתהליכי הפרדה נוספים, המתוארים בפרק שיטות עבודה, התקבל החומר אשר משקלו המולקולארי הוא 516. gr/mole מבנה החומר 1,3-dicaffeoylquinic acid פוענח על ידי שימוש ב- NMR. 45

תמונה מס' 13: המבנה הכימי של חומר הטבע.1,3-diCQA,C3R Resveratrol במחקר זה השתמשנו בשני חומרי טבע נוספים, ו- אשר נרכשו בצורה מסחרית, כפי שמתואר בפרק שיטות עבודה: תמונה מס' 14: המבנה הכימי של חומר הטבע.Resveratrol תמונה מס' 15: המבנה הכימי של חומר הטבע.C3R 46

6.2 מדידת הפעילות האנטיאוקסידנטית של חומרי הטבע ע"י שימוש ב- assay ABTS + בחלק זה בדקנו את הפעילות האנטיאוקסידנטית של חמשת חומרי הטבע השונים, בהם.ABTS השתמשנו במחקר זה, בעזרת הריאגנט השיטה מבוססת על היכולת של האנטיאוקסידנט הנבדק ללכוד את הרדיקל קטיון +,ABTS הנוצר כתוצאה מחמצון של ה-.]77[ על ידי פוטסיום פרסולפט ) 8,(K 2 S 2 O ולעכב את החמצון שלו הפעילות ABTS האנטיאוקסידנטית של המיצויים השונים נבדקה בהשוואה לפעילות של Trolox )אנלוג מסיס במים של ויטמין E(, אשר מהווה מדד לפעילות אנטיאוקסידנטית גבוהה ]77[. בטבלה מס' 1 מסוכמים ערכי ה- IC 50 שהתקבלו עבור האנטיאוקסידנטים השונים, כלומר ריכוז האנטיאוקסידנט בו יש עיכוב של 51% בחמצון ה-.ABTS לפי הטבלה ניתן לראות כי ל- CC פעילות חלשה ביחס ל-,Trolox כלומר נדרש ריכוז גבוה יותר של חומר זה לעומת ה- 1,3- Resveratrol,C3R בכדי לעכב את חמצון ה-.ABTS לעומת זאת, ל- ל- ול- Trolox dicqa פעילות חזקה ביחס ל-,Trolox כלומר נדרש ריכוז נמוך יותר של חומרים אלו לעומת ה- Trolox בכדי לעכב את חמצון ה-.ABTS ניתן לדרג את הפעילות האנטיאוקסידנטית של חומרי הטבע, ולקבוע:.C3R < Resveratrol < 1,3-diCQA < Trolox> CC יש לציין שמכיוון שה- NAO הוא תערובת, וריכוזו נמדד בערכים של,µg/µl לא יכולנו להשוות את פעילותו האנטיאוקסידנטית לשאר חומרי הטבע בהם השתמשנו במחקר ע"י שימוש בשיטת ה- ABTS. עבודה קודמת שנעשתה ע"י וחבריה ]54[ הראתה פעילות Bergman אנטיאוקסידנטית חזקה לנגזרות השונות של ה- NAO. 47

Antioxidant Trolox C3R Resveratrol 1,3-diCQA Cucurbitacin E glucosides NAO IC50 (µm) (average ± S.E) 21.6 ± 0.01 2.3 ± 0.02 10.4 ± 0.01 13.9 ± 0.5 134.3 ± 0.02 173.6 ± 0.01 µg/µl * טבלה מס' 1:.+ ערכי ה-, IC 50 עבור לכידת הרדיקל ABTS על ידי האנטיאוקסידנטים השונים בהשוואה ל-,Trolox אנטיאוקסידנט מסחרי. התוצאות מייצגות ממוצע ± סטיית תקן של 2 ניסויים עם 3 חזרות לכל ניסוי. *מכיוון שה- NAO הוא תערובת, הריכוז נמדד בערכים של.µg/µl 6.3 הפקת אנזים SIRT1 רקומביננטי בכדי לבדוק את השפעתם של חמשת חומרי הטבע בהם השתמשנו במחקר זה על פעילות דה-.SIRT1,SIRT1 אצטילציה in vitro של האנזים הפקנו בחלק זה את האנזים הרקומביננטי.pHEX SIRT1 האנזים הרקומביננטי הופק מפלסמיד מפלסמיד זה מפיקים חלבון.X6 רקומביננטי המתויג HIS בתג היסטידין החלבון הופק כמתואר בפרק שיטות עבודה, ולאחר מכן נוקה מאימידזול כמתואר בפרק שיטות עבודה. האימידזול הוא הנוצר מלח כתוצר ביניים ביצירת היסטידין, ויכול לחקות את המבנה של ההיסטידין. לכן, כאשר הוא נקשר לקולונה הוא יכול לשמש לאילוצית החלבון ע"י תחרות על יוני הניקל הקשורים לקולונה. לאחר הפקת החלבון בוצעה צביעת קומאסי 16(. )תמונה מס' ניתן לראות כי הבנד הימיני SIRT1 ביותר, המייצג חלבון רקומביננטי מסחרי )אשר שימש כביקורת חיובית לניסוי זה( מתאים לגובה של hsirt1 חלבון SIRT1 אנושי, שמשקלו.110kD כמו כן, ניתן להבחין כי 48

0.1 µg/µl התקבלו שתי אלוציות של החלבון: אלוציה בריכוז ואלוציה נוספת בריכוז של 0.5. µg/µl אלו האלוציות איתן המשכנו במחקר. בנוסף, עוצמת הבנדים תואמת לריכוז של החלבון הרקומביננטי שהוטען )מכל אלוציה הוטען,-80 o c מיקרוליטר אחד(. את החלבון הרקומביננטי שהפקנו אחסנו בטמפרטורה של 5mM DTT ו- 11% גליצרול. תמונה מס' 16: צביעת קומאסי של ג'ל אקריל אמיד עם דוגמאות SIRT1 רקומביננטי שהופקו מפלסמיד.pHEX 49

6.4 השפעת חומרי הטבע על פעילות דה-אצטילציה in vitro של האנזים SIRT1 לאחר שהפקנו את חומרי הטבע ואת האנזים SIRT1 הרקומביננטי, עברנו לבחון את השפעתם של חומרי הטבע על פעילות הדה-אצטילציה in vitro של האנזים.SIRT1 לשם כך השתמשנו בשיטת Flour de lys כפי שמתואר בפרק שיטות עבודה, תוך שימוש בריכוזים שונים של חומרי הטבע. עבור כל אחד מחומרי הטבע בוצעו 2 ריאקציות שונות: ריאקצית דה-אצטילציה רגילה, בה נמצאים כל רכיבי הריאקציה בריכוזים שונים של.1 חומר הטבע, פרט לריאקצית הביקורת אשר בוצעה ללא חומר הטבע.,SIRT1 ריאקציה ללא האנזים כאשר ריאקצית הביקורת בוצעה גם ללא.2 האנטיאוקסידנט. עפ"י עבודתו של Cohen וחבריו ]21[, ביצענו תחילה ניסוי עם,Resveratrol כביקורת חיובית לשיטת ה-.Flour de lys 51

6.4.1 השפעת Resveratrol על פעילות דה-אצטילציה in vitro של האנזים SIRT1 תתמונה מס' 7 א 1 ': ריאקצית דה-אצטילציה רגילה וריאקצית ביקורת ללא האנזים SIRT1 בנוכחות ריכוזים שונים של.Resveratrol תמונה מס' 7 ב 1 ': השפעת ריכוזים שונים של Resveratrol על פעילות דה-אצטילציה של האנזים.SIRT1 51

מבחן הדה-אצטילציה נבדק בפלטת 96 באריות. את התמיסות )פרט ל,)Developer האנזים וה- Resveratrol בריכוזים השונים, המומס בבופר הריאקציה, מכניסים לתוך בארית 50 µl בנפחים המתאימים לפי הריכוזים הנבדקים. השלמת נפח הריאקציה ל- נעשית ע"י בופר הריאקציה. האנזים מוסף אחרון. לאחר מכן מתבצעת הדגרה בחושך ב- 37 C למשך 21 Developer שעה, 50 µl הוספת של תמיסת והדגרה דקות בטמפרטורת החדר. העירור מתבצע באורך גל של,360nm הקריאה באורך גל של.460nm ריאקצית הביקורת מבוצעת,SIRT1 באופן זהה לריאקציה הרגילה, פרט לכך שהריאקציה חסרה את האנזים והשלמת נפח הראקציה ל- 50 µl נעשתה ע"י בופר הריאקציה. SIRT1 ההשפעה הישירה של ה- Resveratrol על פעילות הדה-אצטילציה של האנזים היא ההפרש בין רמת הפלורוסנציה שנמדדה בריאקצית הדה-אצטילציה הרגילה וריאקצית הביקורת ללא האנזים בכל אחד מהריכוזים של ה-.Resveratrol התוצאות מייצגות ממוצע ± סטיית תקן של 3 ניסויים שונים. בכל ניסוי נערכו 3 חזרות עבור כל סוג ריאקציה. p < 0.05 vs control (w/o Resveratrol) * p < 0.01 vs control (w/o Resveratrol) ** בתמונה מס' 17 ב' רואים עליה בפעילות הדה-אצטילציה in vitro של האנזים SIRT1 תלוית ריכוז ה-.Resveratrol תוצאות אלו חוזרות על הממצא שה- Resveratrol הינו מאקטב של האנזים,SIRT1 כלומר הביקורת החיובית לשיטה זו עבדה כראוי. כעת עברנו לבחון את השפעתם של ארבעת חומרי הטבע הנוספים בהם השתמשנו במחקר זה. 52

ב 1 6.4.2 השפעת NAO על פעילות דה-אצטילציה in vitro של האנזים SIRT1 תמונה מס' 8 א 1 ': ריאקצית דה-אצטילציה רגילה וריאקצית ביקורת ללא האנזים SIRT1 בנוכחות ריכוזים שונים של.NAO 53 תמונה מס' 8 ': השפעת ריכוזים שונים של NAO על פעילות דה-אצטילציה של האנזים.SIRT1

17 מבחן הדה-אצטילציה נעשה כפי המתואר בפרק שיטות עבודה ובתמונה מס' כאשר ב', in vitro בחלק זה נבדקה השפעתו של ה- NAO על פעילות הדה-אצטילציה של האנזים.SIRT1 ההשפעה הישירה של ה- NAO על פעילות הדה-אצטילציה in vitro של האנזים SIRT1 היא ההפרש בין רמת הפלורוסנציה שנמדדה בריאקצית הדה-אצטילציה הרגילה וריאקצית הביקורת ללא האנזים בכל אחד מהריכוזים של ה-.NAO התוצאות מייצגות ממוצע ± סטיית תקן של 3 ניסויים שונים. בכל ניסוי נערכו 3 חזרות עבור כל סוג ריאקציה. p < 0.05 vs control (w/o NAO) * p < 0.01 vs control (w/o NAO) ** in vitro 18 עפ"י תמונה מס' ניתן לראות ב' ירידה בפעילות הדה-אצטילציה של האנזים IC50 ה- תלוית ריכוז ה- NAO. SIRT1 של ה- NAO, כלומר ריכוז ה- NAO בו ישנה ירידה ב-,)NAO בפעילות האנזים לעומת ה- Control )ריאקצית דה-אצטילציה רגילה ללא ה- 51% NAO הוא.0.83 µg/µl בסביבות כמו כן, העיכוב המקסימאלי בפעילות האנזים ע"י ה- התקבל בריכוז 3.2 µg/µl של.NAO בריכוז זה אחוז העיכוב הוא 95%. 54

6.4.3 השפעת Cucurbitacin על פעילות דה-אצטילציה in vitro של האנזים SIRT1 תמונה מס' 9 א 1 ': ריאקצית דה-אצטילציה רגילה וריאקצית ביקורת ללא האנזים SIRT1 בנוכחות ריכוזים שונים של.Cucurbitacin תמונה מס' 9 ב 1 ': השפעת ריכוזים שונים של Cucurbitacin על פעילות דה-אצטילציה של האנזים.SIRT1 55

17 מבחן הדה-אצטילציה נעשה כפי המתואר בפרק שיטות עבודה ובתמונה מס' כאשר ב', in vitro בחלק זה נבדקה השפעתו של ה- Cucurbitacin על פעילות הדה-אצטילציה של האנזים.SIRT1 in vitro ההשפעה הישירה של ה- Cucurbitacin על פעילות הדה-אצטילציה של האנזים היא ההפרש בין רמת הפלורוסנציה שנמדדה בריאקצית הדה-אצטילציה הרגילה SIRT1 וריאקצית הביקורת ללא האנזים בכל אחד מהריכוזים של ה-.Cucurbitacin התוצאות מייצגות ממוצע ± סטיית תקן של 3 ניסויים שונים. בכל ניסוי נערכו 3 חזרות עבור כל סוג ריאקציה. p < 0.05 vs control (w/o Cucurbitacin) * p < 0.01 vs control (w/o Cucurbitacin) ** בתמונה מס' 19 ב' רואים ירידה בפעילות הדה-אצטילציה in vitro של האנזים SIRT1 תלוית ריכוז ה- ה- של ה- כלומר ריכוז ה- Cucurbitacin בו,Cucurbitacin IC50.Cucurbitacin ישנה ירידה ב- 51% בפעילות האנזים לעומת ה- Control )ריאקצית דה-אצטילציה רגילה ללא ה- הוא כמו כן,,)Cucurbitacin בסביבות 13.22. µm העיכוב הגדול ביותר בפעילות האנזים ע"י ה- של.Cucurbitacin בריכוז זה אחוז 32 µm התקבל בריכוז Cucurbitacin העיכוב הוא 61%. 56

6.4.4 השפעת 1,3-diCQA על פעילות דה-אצטילציה in vitro של האנזים SIRT1 תמונה מס' 20 א': ריאקצית דה-אצטילציה רגילה וריאקצית ביקורת ללא האנזים SIRT1 בנוכחות ריכוזים שונים של.1,3-diCQA תמונה מס' 20 ב': השפעת ריכוזים שונים של 1,3-diCQA על פעילות דה-אצטילציה של האנזים.SIRT1 57

17 מבחן הדה-אצטילציה נעשה כפי המתואר בפרק שיטות עבודה ובתמונה מס' כאשר ב', בחלק זה נבדקה השפעתו של ה- 1,3-diCQA על פעילות הדה-אצטילציה in vitro של האנזים.SIRT1 ההשפעה הישירה של ה- 1,3-diCQA על פעילות הדה-אצטילציה in vitro של האנזים SIRT1 היא ההפרש בין רמת הפלורוסנציה שנמדדה בריאקצית הדה-אצטילציה הרגילה וריאקצית הביקורת ללא האנזים בכל אחד מהריכוזים של ה- 1,3-diCQA. התוצאות מייצגות ממוצע ± סטיית תקן של 3 ניסויים שונים. בכל ניסוי נערכו 3 חזרות עבור כל סוג ריאקציה. p < 0.05 vs control (w/o 1,3-diCQA) * p < 0.01 vs control (w/o 1,3-diCQA) ** בתמונה מס' 21 ב' רואים ירידה בפעילות הדה-אצטילציה in vitro של האנזים SIRT1 תלוית ריכוז ה- 1,3-diCQA. ה- IC50 של ה- 1,3-diCQA, כלומר ריכוז ה- 1,3-diCQA בו ישנה ירידה ב- 51% בפעילות האנזים לעומת ה- Control )ריאקצית דה-אצטילציה רגילה ללא ה-,)1,3-diCQA הוא בסביבות 141.23. µm כמו כן, העיכוב הגדול ביותר בפעילות האנזים ע"י ה- 1,3-diCQA התקבל בריכוז 204 µm של.1,3-diCQA בריכוז זה אחוז העיכוב הוא 61%. 58

6.4.5 השפעת C3R על פעילות דה-אצטילציה in vitro של האנזים SIRT1 תמונה מס' 21 א': ריאקצית דה-אצטילציה רגילה וריאקצית ביקורת ללא האנזים SIRT1 בנוכחות ריכוזים שונים של.C3R 59 תמונה מס' 21 ב': השפעת ריכוזים שונים של C3R על פעילות דה-אצטילציה של האנזים.SIRT1

ר) 17 מבחן הדה-אצטילציה נעשה כפי המתואר בפרק שיטות עבודה ובתמונה מס' כאשר ב', בחלק זה נבדקה השפעתו של ה- C3R על פעילות הדה-אצטילציה in vitro של האנזים.SIRT1 SIRT1 in vitro ההשפעה הישירה של ה- C3R על פעילות הדה-אצטילציה של האנזים היא ההפרש בין רמת הפלורוסנציה שנמדדה בריאקצית הדה-אצטילציה הרגילה וריאקצית הביקורת ללא האנזים בכל אחד מהריכוזים של ה-.C3R התוצאות מייצגות ממוצע ± סטיית תקן של 3 ניסויים שונים. בכל ניסוי נערכו 3 חזרות עבור כל סוג ריאקציה. p < 0.05 vs control (w/o C3R) * p < 0.01 vs control (w/o C3R) ** בתמונה מס' 21 ב' רואים ירידה בפעילות הדה-אצטילציה in vitro של האנזים SIRT1 תלוית ריכוז ה-.C3R ה- IC50 של ה-,C3R כלומר ריכוז ה- C3R בו ישנה ירידה ב- 51% בפעילות,)C3R האנזים לעומת ה- Control יאקצית דה-אצטילציה רגילה ללא ה- הוא C3R בסביבות.23.12 µm כמו כן, העיכוב הגדול ביותר בפעילות האנזים ע"י ה- התקבל בריכוז 47 µm של.C3R בריכוז זה אחוז העיכוב הוא 54%. 61

לסיכום חלק זה, בו בדקנו את השפעתם של ארבעת חומרי הטבע בהם השתמשנו במחקר זה )כאשר ה- Resveratrol שימש ביקורת חיובית לשיטה בה השתמשנו בחלק זה(, נציג בטבלה מס' 2 את ה- IC50 ואת אחוז העיכוב המקסימאלי של כל אחד מחומרי הטבע על פעילות דה- אצטילציה in vitro של האנזים :SIRT1 Compound NAO Cucurbitacin C3R 1,3-diCQA IC50 (µm) (average ± S.E) 0.83 µg/µl ± 0.06 * 13.22 ± 4.18 23.12 ± 0.003 141.23 ± 1.25 Maximum % inhbition 95% ± 0.01 61% ± 0.01 54% ± 0.01 61% ± 0.02 טבלה מס' 2: ריכוז ה- IC50 ואחוז העיכוב המקסימאלי של כל אחד מחומרי הטבע על פעילות דה-אצטילציה in vitro של האנזים.SIRT1 התוצאות מייצגות ממוצע ± סטיית תקן של 3 ניסויים. *מכיוון שה- NAO הוא תערובת, הריכוז נמדד בערכים של.µg/µl בכדי לבחור את חומר הטבע איתו המשכנו את המחקר במודל של שורת תאים של סרטן.]1[ Jung-Hynes הערמונית מאדם, נעזרנו בעבודתה של וחבריה כפי שצוין בפרק המבוא,,PC3 בעבודה זו הראו החוקרים כי החלבון SIRT1 מבוטא ביתר בצורה משמעותית בתאי לעומת תאי אפיתל בריאים מערמונית באדם. על בסיס ממצאים אלו, אנו משערים כי הורדת ביטוי החלבון SIRT1 ועיכוב פעילותו תביא לעצירה בשגשוג של תאי סרטן הערמונית, וכך יתכן ונוכל למנוע את התפתחות סרטן הערמונית. ככל שריכוז ה- IC50 נמוך יותר, הרי שהחומר מעכב חזק יותר את פעילות האנזים. מכיוון שבכל ארבעת חומרי הטבע שבדקנו, שנמצאו מעכבים את פעילות האנזים,SIRT1 לא קיבלנו עיכוב ליניארי לכל טווח הריכוזים שבדקנו, חישבנו את ריכוזי ה- בו מתקבלת ירידה ב- 51% מהפעילות המקסימאלית של האנזים. IC50 בקירוב, עפ"י הטווח 61

לפי ערכי ה - IC50 נוכל להשוות את חוזק העיכוב של חומרי הטבע אותם בדקנו, פרט ל- NAO שהמסה המולרית שלו איננה מוגדרת, מפני שהוא תערובת של 2 מולקולות שונות. יחד עם זאת, נוכח השפעתו החזקה על פעילות הדה-אצטילציה in vitro של האנזים SIRT1 95% NAO SIRT1 עיכוב בפעילות in vitro דה-אצטילציה של האנזים בריכוז הגבוה ביותר של )כפי שניתן לראות בתמונה מס' 18 ב'(, נוכח העובדה שה- NAO מקורו בצמח אכיל, בלתי רעיל וזמין )תרד( ובהסתמך על עבודתו של Bakshi וחבריו ]48[ המראה השפעה מיטיבה של NAO במניעת סרטן הערמונית, החלטנו לבדוק האם השפעתו המיטיבה של ה NAO במודל תאי סרטן הערמונית מאדם מתווכת באמצעות החלבון.SIRT1 6.5 השפעת טיפול ב- NAO על חיות תאי PC3 לאחר שבחרנו את חומר הטבע NAO להמשך המחקר, עברנו לבדוק את השפעתו של ה- NAO NAO.PC3 במודל תרביות תאים של תאי בדקנו תחילה האם ה- מסוגל להוריד את רמת שגשוג התאים. לשם כך השתמשנו בשיטת XTT המתוארת בפרק שיטות עבודה. 6.5.1 השפעת טיפול ב- NAO על שגשוג של תאי PC3 תמונה מס' 22: השפעת NAO על יכולת השגשוג של תאי PC3 לאחר אינקובציה של 72 שעות. 5 10 3 תאי PC3 נזרעו לבארות בפלטה של 96 בארות. הבדיקה נעשתה כמתואר בפרק שיטות עבודה. התוצאות מייצגות ממוצע ± סטיית תקן של 3 ניסויים עם 4 חזרות לכל ניסוי. p < 0.01 vs control ** 62

בתמונה מס' 22 רואים שטיפול ב NAO למשך 72 שעות גרם לירידה משמעותית )0.01 < p( בשגשוג של תאי סרטן הערמונית.PC3 בריכוז NAO של 0.8 µg/µl התקבל עיכוב של 88% בשגשוג התאים, בריכוז של 1.6 µg/µl התקבל עיכוב של 93% בשגשוג התאים ובריכוז של 3.2 µg/µl התקבל עיכוב של 96%. 6.5.2 השפעת זמן הטיפול ב- NAO על שגשוג של תאי PC3 כדי לבדוק את יכולת גדילת התאים לאורך זמן, בנוכחות,NAO נערכו בדיקות של שגשוג התאים בזמנים שונים )24, 48 ו- 72 שעות( ובמינונים שונים של,0.8,1.6 3.2 µg/µl( NAO וביקורת ללא.)NAO תמונה מס' 23: השפעת הזמן וריכוז ה- NAO על יכולת השגשוג של תאי.PC3 5 10 3 תאי PC3 נזרעו לבארות בפלטה של 96 בארות. הבדיקה נעשתה כמתואר בפרק שיטות עבודה. התוצאות מייצגות ממוצע ± סטיית תקן של 3 ניסויים עם 4 חזרות לכל ניסוי. 63

NAO בתמונה מס' 23 ניתן לראות את השפעת הזמן וריכוז ה- על יכולת השגשוג של תאי 72 48,24( בכל פרק זמן בו נבדקה רמת השגשוג של תאי PC3 ישנה ירידה שעות( ו.PC3 ברמת השגשוג של התאים עם העלייה בריכוז ה-,NAO לדוגמא: לאחר 24 שעות, נראה עיכוב של 31% ברמת השגשוג של התאים בריכוז 0.8 µg/µl של,NAO עיכוב של 68% בריכוז של,3.2 µg/µl ועיכוב של 72% בריכוז של אולם עם העלייה בזמן, אחוז העיכוב 1.6 µg/µl ברמת השגשוג, עם העלייה בריכוז ה- NAO, יורד. לדוגמא: לאחר 48 שעות, ישנו עיכוב של 47% בריכוז של 0.8 µg/µl של,NAO ועיכוב של 88% בריכוז של 1.6 µg/µl של,NAO כלומר עליה של 41% בעיכוב השגשוג בין שני ריכוזים אלו. לעומת זאת, לאחר 72 שעות, ישנו עיכוב של 89% בריכוז של 0.8 µg/µl של,NAO ועיכוב של 93% בריכוז של 1.6 µg/µl של,NAO כלומר עליה של 4% בלבד בעיכוב השגשוג בין שני ריכוזים אלו. יש לציין כי לאורך כל הזמנים ובכל הריכוזים של NAO ממשיכה התחלקות התאים, כלומר לא מתרחשת עצירה מוחלטת של שגשוג התאים. 6.5.3 האם השפעת הטיפול ב- NAO על שגשוג תאי PC3 מתווכת באמצעות החלבון?SIRT1 NAO בכדי לבדוק האם מנגנון העיכוב של שגשוג תאי PC3 באמצעות ע"י החלבון מתווך,SIRT1 החלטנו לבצע השתקה גנטית של החלבון SIRT1 בתאי.PC3 תאי PC3 אחרים שימשו.SIRT1 אותנו כתאי ביקורת, לא ביצענו בהם השתקה של החלבון גנטית מטרתנו הייתה להשוות בין השפעת הטיפול ב- NAO על רמת השגשוג של התאים בהם הייתה השתקה גנטית של החלבון SIRT1 לבין רמת השגשוג של התאים בהם לא הייתה השתקה גנטית של החלבון.SIRT1 תחילה ביצענו השתקה גנטית של החלבון SIRT1 בתאי PC3 בשיטת,siRNA תוך שימוש ב- sirna כנגד,SIRT1 כמתואר בפרק שיטות עבודה. תאי הביקורת טופלו ב- sirna ביקורת, אשר אינו משתיק את החלבון.SIRT1 64

א 2 sirna PC3 בכדי לבדוק האם הייתה השתקה של החלבון SIRT1 בתאי שטופלו ב- כנגד ביצענו,Western Blot כמתואר בפרק שיטות עבודה. הרצנו את כלל החלבונים,SIRT1 מהליזאט של התאים שעברו השתקה גנטית לחלבון SIRT1 ואת כלל החלבונים מהליזאט של התאים שלא עברו השתקה גנטית לחלבון,SIRT1 והגבנו את הממברנה עם נוגדן כנגד.SIRT1 ת תמונה מס' 4 א 2 ': בדיקת רמת SIRT1 בתאי PC3 שטופלו ב- sirna כנגד SIRT1 לעומת תאי PC3 שטופלו ב- sirna ביקורת. ביצוע ה- sirna ובדיקת רמות החלבונים SIRT1 ו- Actin )אשר משמש כביקורת הטענה( מתוארים בפרק שיטות עבודה. באמצעות התוכנה ImageJ כימתנו את רמות החלבון שקיבלנו:.' תמונה מס' 4 ב 2 ': כימות רמות החלבון SIRT1 כפי שהתקבלו בתמונה מס' 4 p < 0.01 vs sicontrol ** 65

עפ"י תמונות ה- Western Blot ועפ"י הכימות שביצענו לתמונה, ניתן לראות כי ישנה ירידה משמעותית )0.01 < p( של כ 71% ברמת החלבון SIRT1 בתאי PC3 שטופלו ב- sirna כנגד SIRT1 לעומת תאי PC3 שטופלו ב- sirna ביקורת. לאחר ביצוע ה-,siRNA קצרנו כל אחד משני סוגי התאים וזרענו אותם בבארות של פלטת 96 בארות. לאחר מכן טיפלנו בכל אחד מסוגי התאים ב- NAO בשלושה ריכוזים:,0.8 1.6 ו-.3.2µg/µl בנוסף, זרענו תאי PC3 נוספים וטיפלנו בהם ב- DMEM ללא פנול רד. תאים אלו שימשו כביקורת. הטיפול נמשך 24 שעות. לאחר 24 שעות מדדנו את רמת השגשוג של כל אחד מסוגי התאים בשיטת,XTT כמתואר בפרק שיטות עבודה. תמונה מס' 25: השפעת NAO על יכולת השגשוג של תאי PC3 לאחר אינקובציה של 24 שעות בתאי PC3 שטופלו ב- sirna כנגד SIRT1 לעומת תאי PC3 שטופלו ב- sirna ביקורת. p < 0.01 vs CONTROL ** 66

עפ"י תמונה מס' 25, נראה כי בשני סוגי התאים חלה עלייה ברמת השגשוג של התאים בריכוז של 0.8 µg/µl של NAO לעומת ה-.Control לאחר מכן, בריכוז של 1.6 µg/µl של NAO חלה ירידה ברמת השגשוג של התאים לעומת ה-,Control כלומר תאים שטופלו ב- DMEM ללא כנגד SIRT1 sirna PC3 פנול רד, בכל אחד משני סוגי התאים. בתאי שעברו טיפול עם חל עיכוב של 14% ברמת השגשוג של התאים ובתאי PC3 שעברו טיפול עם sirna ביקורת חל p = 0.2 ( עיכוב של 5%, אולם בשני סוגי התאים, העיכוב לא היה משמעותי שני עבור המקרים(. לעומת זאת, בריכוז של 3.2 µg/µl של NAO חל עיכוב של 43% ברמת השגשוג של התאים בתאי PC3 שעברו טיפול עם sirna ביקורת לעומת תאי הביקורת שטופלו ב- DMEM ללא פנול רד, כאשר עיכוב זה הינו משמעותי )0.001 < p(, ואילו תאי PC3 שעברו טיפול עם sirna כנגד,SIRT1 בהם חל עיכוב של 32% ברמת השגשוג של התאים לעומת תאי הביקורת שטופלו ב- DMEM ללא פנול רד, כאשר עיכוב זה אינו משמעותי )0.05 > p(. כלומר, כאשר NAO,)SIRT1 sirna( SIRT1 ישנה השתקה של החלבון גנטית כנגד השפעת הטיפול ב- על רמת השגשוג של תאי PC3 קטנה יותר לעומת תאי PC3 שבהם אין השתקה גנטית של החלבון sirna( SIRT1 ביקורת(. מניסוי זה הסקנו כי השפעתו של ה- NAO על רמת השגשוג של תאי מתווכת, ככל הנראה, באמצעות החלבון.SIRT1 PC3,PC3 NAO בשלב זה עברנו לבדוק מהו המנגנון בו ה- משפיע על שגשוג תאי המתווך Jung-Hynes 2118 באמצעות החלבון.SIRT1 כפי שהזכרנו בפרק המבוא, בשנת פרסמו וחבריה ]1[ את עבודתם, בה הראו כי החלבון SIRT1 מבוטא ביתר בצורה משמעותית בתאי,PC3 לעומת תאי אפיתל בריאים מערמונית באדם. הביטוי ביתר של SIRT1 הוא ברמת ביטוי החלבון וברמת פעילותו האנזימתית, לכן בדקנו את ההשערה האם מנגנון פעילותו והשפעתו של ה- NAO על שגשוג תאי PC3 הוא באמצעות הורדת רמת הביטוי והפעילות האנזימתית של החלבון.SIRT1 67

ב 2 א 2 6.6 השפעת NAO על רמת ביטוי החלבון SIRT1 בתאי PC3 5 X 10 5 תאי PC3 נזרעו בצלחת של פלטת 6 באריות. לאחר 24 שעות הוחלף מדיום הגידול של התאים, והתאים טופלו עם,0.8(,1.6 3.2 µg/µl( NAO אשר הומסו ב- DMEM ללא פנול רד, למשך 24 שעות. לתאי הביקורת הוסף נפח של DMEM ללא פנול רד השווה לנפח הטיפול. Actin רמות החלבונים SIRT1 ו- )אשר משמש כביקורת הטענה( נבדקו בשיטת Western Blot כמתואר בפרק שיטות עבודה. תמונה מס' 6 א 2 ': בדיקת רמות SIRT1 בתאי PC3 שטופלו בריכוזים עולים של NAO לעומת תאי PC3 ביקורת. זוהי תוצאה מייצגת מ- 3 ניסויים שונים. באמצעות התוכנה ImageJ כימתנו את רמות החלבון שקיבלנו:.' תמונה מס' 6 ': כימות רמות החלבון SIRT1 כפי שהתקבלו בתמונה מס' 6 68

SIRT1 בתאי PC3 תלוית עפ"י תמונה מס' 26 א', ניתן לראות שישנה ירידה ברמת החלבון ריכוז ה- NAO. בתמונה מס' 26 ב' ביצענו כימות לרמת החלבון SIRT1 עבור שלושת הניסויים החוזרים שעשינו, ונראה כי הירידה ברמת החלבון הינה משמעותית: בריכוז 0.8 µg/µl של NAO ישנה ירידה משמעותית )0.05 < p( של כ- 11% ברמת החלבון. בריכוז 1.6 µg/µl של 3.2 µg/µl של כ- 31% ברמת החלבון, ואילו בריכוז p( < )0.01 ישנה ירידה משמעותית NAO של NAO ישנה ירידה משמעותית )0.01 < p( של כ- 41% ברמת החלבון. מניסויים אלו אנו יכולים להסיק כי NAO מוריד את ביטוי החלבון.SIRT1 6.7 השפעת NAO על פעילות הדה-אצטילציה של החלבון SIRT1 בתאי PC3 לאחר שהוכחנו כי הטיפול ב- NAO מוריד את רמות החלבון SIRT1 בתאי,PC3 רצינו לבדוק.NAO גם האם פעילותו האנזימתית של החלבון בתאים ירדה עקב הטיפול ב- אחת הפעילויות האנזימתיות הידועות של החלבון,SIRT1 הקשורה לשגשוג תאים, היא דה- אצטילציה על ליזין 382 בפקטור השעתוק p53. החלבון SIRT1 מעכב את פעילות p53, בין היתר, ע"י דה-אצטילציה בליזין 382, ובכך מעכב את האפופטוזיס תלוי ]39[. p53 69

תמונה מס' 27: NAO מוריד את פעילות החלבון SIRT1 בתאי PC3 כפי שמתבטא בדה- אצטילציה של הסובסטראט 5 X 10 5 p53. תאי PC3 נזרעו בצלחת של פלטת 6 באריות. לאחר 24 שעות הוחלף מדיום הגידול של התאים, והתאים טופלו עם ( NAO 3.2,0.8,1.6 )µg/µl אשר הומסו ב- DMEM ללא פנול רד, למשך 24 שעות. לתאי הביקורת הוסף נפח של (Ac-p53( Acetylate p53 ללא פנול רד השווה לנפח הטיפול. רמות החלבונים p53, DMEM ו- Actin )אשר משמש כביקורת הטענה( נבדקו בשיטת Western Blot כמתואר בפרק שיטות עבודה. Western בתמונה מס' 27, רמת האצטילציה מוצגת, מלבד הבנדים שהתקבלו בשיטת ה-,Ac-p53/Total p53 גם על ידי הצגת צפיפות בתוכנת,ImageJ בחישוב שהתקבל,Blot מהטיפול עם כל אחד מריכוזי ה- NAO ביחס לערך שהתקבל מהטיפול ב- Control, ביחידות שרירותיות. עפ"י תמונה מס' 27, נראה כי טיפול ב- NAO מוריד את פעילות הדה-אצטילציה של החלבון SIRT1 בתאי PC3 כפי שמתבטא ברמה גבוהה יותר של החלבון p53 המכיל קבוצות אצטיל כתלות בריכוז ה-.NAO הכמות הכוללת של p53 בכל הליזאטים השונים שהוכנו מתאי PC3 הייתה דומה, עובדה המצביעה על דה-אצטילציה אמיתית שאינה נובעת מרמות גבוהות יותר של החלבון p53. 71

7. דיון בעבודה זו מצאנו כי,NAO תערובת פוליפנולית המופקת מעלי תרד, עיכבה את פעילותו האנזימתית in vitro של החלבון.SIRT1 במודל תרביות תאים מצאנו כי ה- NAO מונע ומקטין את התפתחות סרטן הערמונית, ככל הנראה באמצעות הורדת הביטוי ועיכוב פעילות הדה- אצטילציה של החלבון SIRT1 כפי שבא לידי ביטוי בעליה ברמת האצטילציה של פקטור השעתוק p53. פעילות זו של ה- NAO מצביעה על הפוטנציאל לשימוש קליני בחומר זה. סרטן הערמונית הינה מחלה הקשורה בהזדקנות. הגורמים להתפתחות סרטן הערמונית אינם ברורים לגמרי, אך ברור שגורם הסיכון העיקרי להתפתחות גידול בבלוטת הערמונית הוא הגיל. בהעדר אפשרויות טיפול מספקות לסרטן הערמונית, טיפול מניעתי יכול להוות גישה טיפולית אשר תגרום להפחתת מספר המקרים של התפתחות המחלה. נתונים אפידמיולוגים מציעים שצריכה של מזון צמחי, המכיל רמות גבוהות של אנטיאוקסידנטים, יכולה להאט או למנוע הופעה של סרטן ]79[. חקירת הקשר של צריכת פירות וירקות וסיכון לסרטן הערמונית בגברים מתחת לגיל 65, מראה שצריכה גבוהה של ירקות קשורים בהקטנת הסיכון לסרטן הערמונית ]81[, לכן עיכוב, אפילו מתון, בהתפתחות סרטן הערמונית באמצעות התערבות תזונתית, תוכל אולי לגרום לירידה בהיקף החולים. בשנת 2118 פרסמו Jung-Hynes וחבריה ]1[ את עבודתם, בה הראו כי החלבון,SIRT1 אשר מעורב במגוון תהליכים פתולוגיים הקשורים להזדקנות, מבוטא ביתר בצורה משמעותית בתאי תאי SIRT1 סרטן הערמונית מאדם לעומת תאי אפיתל בריאים מערמונית באדם. הביטוי ביתר של הוא ברמת ביטוי החלבון וברמת פעילותו האנזימתית. על בסיס ממצאים אלו, השערת המחקר הייתה שלנו כי הורדת ביטוי החלבון SIRT1 ועיכוב פעילותו תביא לעצירה בשגשוג של תאי סרטן הערמונית, וכך יתכן ונוכל למנוע את התפתחות סרטן הערמונית. 71

במחקר זה בחנו את הפוטנציאל של ארבעה חומרי טבע, בעלי פעילות אנטיאוקסידנטית, כמעכבים של האנזים.SIRT1 השתמשנו בעלי תרד שמהם מצינו antioxidant(,)natural את ה- NAO אנטיאוקסידנט טבעי Grossman במים אשר מסיס בודד לראשונה במעבדתו של במהלך סקירה של מעכבי חמצון ]53[ Bergman שומנים ]51,52[. בעבודתם של וחבריה דווח כי המרכיבים העיקריים נוגדי החמצון של התמצית המימית של עלי תרד הם נגזרות של פלבנואידים ושל p-coumaric acid בתרביות תאי סרטן הערמונית נמצא כי ה- NAO גורם להאטה במחזור התא ]48[. בנוסף השתמשנו בצמח אבטיח הפקועה, שממנו מצינו את ה-.Cucurbitacin E glucosides פעילויות אנטיאוקסידנטיות נמצאו באבטיח הפקועה, הידוע כצמח מרפא. בעבודה שנעשתה Cucurbitacin E במעבדתו של Grossman דווח לראשונה על פעילות אנטיאוקסידנטית של.]49[ וכן על פעילותם כלוכדי תרכובות חמצן פעילות (ROS) שונות עבודה נוספת glucosdies Cucurbitacin E glucosides הראתה כי Cucurbitacin B glucosides ו- הם בעלי פעילות מעכבת של שגשוג תאי סרטן השד ע"י מנגנון עצירת מחזור התא בשלב ה- G2/M וע"י השראת אפופטוזיס ]49[. כמו כן השתמשנו בטיון דביק, ממנו מצינו את ה- (1,3-diCQA).1,3-Dicaffeate Quinic Acid במחקר שבוצע במעבדתו של Grossman דווח לראשונה על בידודם ופעילותם האנטיאוקסידנטית של קבוצת החומרים המשתייכים למשפחת ה-( CQA ),Caffeoylquinic acid אשר בודדו מהצמח טיון דביק. נמצא כי לחומרים אלו פעילות אנטיאוקסידנטית חזקה בהשוואה לאנטיאוקסידנטים מסחריים ]65[. Cyanidin-3-rhamnoglucoside (C3R) בנוסף השתמשנו באנטיאוקסידנט ממשפחת האנטוציאנינים. מחקרים רבים שנעשו הראו שלמשפחה זו יש יכולת לעכב שגשוג תאי סרטן שונים ולעכב התפתחות סוגי סרטן נוספים, במנגנונים שונים. לדוגמא, עיכוב פעילות אנזימי הציקלואוקסיגנזות ]51,81[ וחסימת הפעלה של מסלול ה- MAP קינאזות ]82[. 72

(HPLC, TLC) הבידוד של חומרי הטבע השונים נעשה בשיטות כרומטוגרפיות והזיהוי בשיטת.ABTS לאחר מכן נבדקה הפעילות האנטיאוקסידנטית של חומרי הטבע בעזרת הריאגנט.NMR בשיטה זו נמדדת סך כל הפעילות האנטיאוקסידנטית activity).(total antioxidant השיטה מבוססת על היכולת של האנטיאוקסידנט הנבדק ללכוד את הרדיקל קטיון,ABTS + הנוצר.]77[ כתוצאה מחמצון של ABTS ה- פעילות החומרים השונים נבחנה בהשוואה לפעילות של Trolox )אנלוג מסיס במים של ויטמין E(. חומר זה מהווה מדד לפעילות אנטיאוקסידנטית גבוהה ]77[. באמצעות שיטת ה- ABTS + נמדדו ערכי ה- IC50 התוצאות שהתקבלו, נראה שערכי ה- IC50 של חומרי הטבע ביחס ל-.Trolox עפ"י שהתקבלו עבור ה- Resvertrol,C3R וה- 1,3-diCQA נמוכים,Trolox ביחס ל- כלומר הם בעלי פעילות אנטיאוקסידנטית חזקה יותר מה- Trolox,,Trolox Cucurbitacin ה- ערך ואילו IC50 שהתקבל ה- עבור גבוה ביחס ל- כלומר הוא בעל פעילות אנטיאוקסידנטית חלשה יותר מה-.Trolox בנוסף, עבודה קודמת שנעשתה ע"י וחבריה ]54[ הראתה פעילות אנטיאוקסידנטית חזקה לנגזרות השונות של ה- NAO. Bergman תוצאות אלו מאפיינות את חומרי הטבע בהם השתמשנו במחקר זה כבעלי פעילות אנטיאוקסידנטית..SIRT1 לאחר מכן נבדקה השפעת חומרי הטבע על פעילות דה-אצטילציה in vitro של האנזים לשם בדיקה זו הפקנו אנזים SIRT1 רקומביננטי. מתהליך ההפקה קיבלנו מספר אלוציות של האנזים SIRT1 בריכוזים שונים, כאשר עבור כל ריאקציה בשיטת ה- Flour de Lys השתמשנו ב-,]21[ Cohen.]21[ של אנזים SIRT1 רקומביננטי עפ"י עבודתו של וחבריו ביצענו תחילה 1 µg ניסוי עם,Resveratrol כביקורת חיובית לשיטת ה-,Flour de lys ואכן קיבלנו עלייה בפעילות דה-אצטילציה in vitro של האנזים. לאחר מכן בדקנו את ארבעת חומרי הטבע השונים, כאשר עפ"י התוצאות שקיבלנו, כל חומרי הטבע שנבדקו מעכבים את פעילות האנזים. תוצאות אלו מעידות כי חומרי הטבע הנ"ל יכולים לשמש כחומרים בעלי פוטנציאל אנטי סרטני בתאי סרטן הערמונית מאדם ]1[. תוצאות אלו מחזקות תוצאות קודמות שהתקבלו מעובדות שונות שנעשו 73

עם ארבעת חומרי הטבע השונים שבדקנו, בהן נמצא כי לכל אחד מחומרי הטבע ישנו פוטנציאל אנטי סרטני בתאים סרטניים שונים ]48,49,50[. עפ"י התוצאות שהתקבלו בחלק זה ועפ"י עבודה קודמת שנעשתה עם ה- NAO ]48[ החלטנו להמשיך את עבודת המחקר עם ה- NAO. NAO בשלב הבא בדקנו את הפוטנציאל של ה- כחומר מעכב שגשוג של תאי סרטן הערמונית NAO,PC3 NAO תאי מאדם,.PC3 מצאנו כי עיכב את שגשוג תאי כתלות בריכוזו. טיפול ב למשך 72 שעות גרם לירידה משמעותית )0.01 < p( בשגשוג של תאי.PC3 כמו כן נבדקה השפעת.PC3 זמן הטיפול ב- NAO על שגשוג תאי נערכו בדיקות של שגשוג התאים בזמנים שונים ובמינונים שונים של.NAO בכל פרק זמן בו נבדקה רמת השגשוג של תאי PC3 התקבלה ירידה ברמת השגשוג של התאים עם העלייה בריכוז ה-.NAO תוצאות אלו מחזקות את ההשערה שלנו כי NAO הוא בעל פוטנציאל אנטי סרטני במודל סרטן הערמונית מאדם. אולם, יש לציין כי עם העלייה בזמן, אחוז העיכוב ברמת השגשוג של התאים, עם העלייה בריכוז ה-,NAO יורד. ככל הנראה, ה- NAO מתפרק בתאים עם העלייה בזמן, ולכן השפעתו האנטי-סרטנית הולכת ופוחתת. בעבודה קודמת שנעשתה במעבדתו של Grossman התקבלו תוצאות דומות ]48[. PC3 בשלב הבא, רצינו לבדוק האם פעילותו של ה- NAO כמעכבת תאי של שגשוג מתווכת באמצעות החלבון.SIRT1 לשם כך ביצענו השתקה גנטית של החלבון SIRT1 בתאי PC3 בשיטת,siRNA כאשר תאי PC3 אחרים שימשו אותנו כתאי ביקורת, בהם לא בוצעה השתקה גנטית של החלבון.SIRT1 מטרתנו הייתה להשוות את השפעת הטיפול ב- NAO על רמת השגשוג של התאים בהם הייתה השתקה גנטית של החלבון SIRT1 לעומת השפעת הטיפול ב- NAO על רמת השגשוג של התאים בהם לא הייתה השתקה גנטית של החלבון.SIRT1 עפ"י התוצאות שהתקבלו, בריכוז של 3.2 µg/µl של NAO חל עיכוב של 43% ברמת השגשוג של תאי PC3 שעברו טיפול עם sirna ביקורת, כאשר עיכוב זה הינו משמעותי )0.001 < p(, לעומת תאי PC3 שעברו טיפול עם sirna כנגד,SIRT1 בהם חל עיכוב של 32% ברמת השגשוג של התאים, כאשר עיכוב זה אינו משמעותי 74

,SIRT1 מכאן הסקנו, שכאשר ישנה השתקה של החלבון גנטית השפעת הטיפול ב-.)p > 0.05( NAO על רמת השגשוג של תאי PC3 קטנה יותר לעומת תאי PC3 שבהם אין השתקה גנטית של החלבון,SIRT1 כלומר השפעתו של ה- NAO על רמת השגשוג של תאי PC3 מתווכת, ככל הנראה, באמצעות החלבון.SIRT1 תוצאות אלו חיזקו את ההשערה עליה ביססנו את המחקר, כי החלבון SIRT1 יכול להוות מטרה ובעל חשיבות קריטית במנגנון הטיפול בסרטן הערמונית מאדם, וזאת עפ"י מחקר קודם שנעשה ]1[ בו הראו כי החלבון SIRT1 מבוטא ביתר בצורה משמעותית בתאי PC3 לעומת תאי תאי אפיתל בריאים מערמונית באדם. כעת רצינו לבדוק מהו המנגנון, המתווך באמצעות החלבון,SIRT1 בו ה- NAO משפיע על שגשוג ]1[ Jung-Hynes תאי.PC3 עבודתה של וחבריה היוותה את הבסיס להשערת המחקר שלנו כי PC3 מנגנון פעילותו והשפעתו של ה- NAO על שגשוג תאי הוא באמצעות הורדת רמת הביטוי והפעילות האנזימתית של החלבון.SIRT1 לכן, בשלב הבא בדקנו את השפעת NAO על רמת ביטוי החלבון SIRT1 בתאי.PC3 עפ"י התוצאות שהתקבלו הסקנו שישנה ירידה משמעותית )0.05 < p( ברמת החלבון SIRT1 בתאי,PC3 התלויה בריכוז ה- NAO..SIRT1 בנוסף, בדקנו האם ה- NAO משפיע על פעילותו האנזימתית של החלבון פעילותו האנזמיתית של החלבון SIRT1 היא דה-אצטילציה. אחד הסובסטרטים הידועים של החלבון SIRT1 הוא פקטור השעתוק p53. פקטור השעתוק p53 משפעל בעיקר גנים ספציפיים הקשורים p53 SIRT1 לאפופטוזיס, וכך גורם לעיכוב בשגשוג של תאי סרטן. החלבון מעכב את פעילות באמצעות דה-אצטילציה על מספר שיירי ליזין ב- p53, ובכך מגביר שגשוג תאים ]38[. לכן שיערנו שאם נעכב את פעילות החלבון,SIRT1 הרי שתהיה עליה ברמת האצטילציה של פקטור השעתוק p53, הפעלה של פקטור השעתוק, שפעול גנים הקשורים לאפופטוזיס ]39[, וכתוצאה מכך ירידה בשגשוג תאי סרטן הערמונית. עפ"י התוצאות שהתקבלו, נראה כי טיפול ב- NAO מוריד את 75

p53,sirt1 פעילות הדה-אצטילציה של החלבון כפי שמתבטא ברמה גבוהה יותר של החלבון המכיל קבוצות אצטיל כתלות בריכוז ה- NAO. כמו כן, הכמות הכוללת של p53 בכל הליזאטים השונים שהוכנו מתאי PC3 הייתה דומה, עובדה המצביעה על דה-אצטילציה אמיתית שאינה נובעת מרמות גבוהות יותר של החלבון p53. תוצאות נוספות אלו חיזקו את השערתנו, כי מנגנון פעילותו והשפעתו של ה- NAO על שגשוג תאי PC3 הוא, בין היתר, באמצעות הורדת רמת הביטוי והפעילות האנזימתית של החלבון SIRT1 ומחזקים את התוצאות שהתקבלו בעבודה עליה ביססנו את ההשערה שלנו ]1[. עפ"י התוצאות שהתקבלו נוכל להציע את מנגנון הפעילות הבא של ה- NAO בתאי סרטן הערמונית מאדם: תמונה מס' 28: הצעה למנגנון פעילותו של NAO כמונע ומקטין את התפתחות סרטן הערמונית בתיווך של החלבון.SIRT1 76

SIRT1 יש לציין כי, ככל הנראה, פעילות ה- NAO אינה מתווכת באמצעות החלבון אלא בלבד, באמצעות חלבונים נוספים ]48[, וכי השפעת עיכוב פעילות ה- SIRT1 על תהליך האפופטוזיס אינה מתווכת באמצעות אצטילציה על פקטור השעתוק p53 בלבד, וככל הנראה סובסטרטים נוספים של החלבון SIRT1 מעורבים בתהליך זה. לסיכום: בעבודה זו בודדנו חומרי טבע, בעלי פעילות אנטיאוקסידנטית, מצמחים שונים, ונבחנה לראשונה השפעתם על פעילות הדה-אצטילציה in vitro של האנזים.SIRT1 מתוך חומרי הטבע שנבדקו, נבדק ה- NAO, שנמצא כמעכב החזק ביותר in vitro של האנזים,SIRT1 במודל תרביות תאים של תאי סרטן ערמונית מאדם. ה- NAO נמצא כחומר טבע המעכב את שגשוג תאי סרטן הערמונית, כאשר פעילותו מתווכת באמצעות החלבון,SIRT1 המבוטא והפעיל ביתר בתאים אלו,SIRT1 במחקר זה מצאנו כי ה- NAO מוריד את רמת הביטוי של החלבון ואת פעילותו.]1[ האנזימתית כדה-אצטילאז על אחד מהסובסטרטים הידועים שלו - פקטור השעתוק p53. עיכוב פעילות אנזימתית זאת גורמת להפעלת פקטור השעתוק p53, אשר בתורו מוריד את רמת השגשוג של תאי סרטן הערמונית. פעילות זו של ה- NAO, כמונע ומקטין את התפתחות סרטן הערמונית, בין היתר באמצעות הורדת הביטוי ועיכוב פעילות הדה-אצטילציה של החלבון,SIRT1 מצביעה על האפשרות לשימוש קליני בחומר זה. 77

8. ביבליוגרפיה 1. Jung-Hynes, B., Nihal, M., Zhong, W. and Ahmad, N. (2008). Role of sirtuin histone deacetylase SIRT1 in prostate cancer. A target for prostate cancer management via its inhibition?. Journal of biological chemistry. 284(6), 3823-3832. 2. Vogelstein, B. and Kinzler, KW. (1993). The multistep nature of cancer. Trends Genet. 9(4), 138-141. 3. Motwani, BT., Shafir, M., Merrick, M., Tepper, J. and Bruckner, HW. (1997). Adenocarcinoma of the colon and rectum. In: Cancer medicine, 4 th ed (Holland, J.F., Sast, R.C., Morton, D.L., Frei, E., Kufe, D.W. and Weichselbaum, R. R.,eds.). Williams and Wilkins, Baltimore, MD, pp. 2029-2072. 4. Oesterling, J., Fuks, Z., Lee, CT. and Scher, HI. (1997). In: Cancer: Principles and Practice of Oncology, 5 th ed. Lippincott-Raven, Philadelphia, PA, pp. 1323-1386. 5. Ross, RK. and Henderson, BE. (1994). Do diet and androgens alter prostate cancer risk via a common etiologic pathway?. J. Natl. Cancer lnst. 86(4), 252-254. 6. Sieck, GC. (2003). Physiology of aging. J. Appl Physiol. 95(4), 1333-1334. 7. Harman, D. (1956). Aging: a theory based on free radical and radiation chemistry. Journal of gerontology. 11(3), 298-300. 8. Fleshner, NE. and Klotz, LH. (1999). Diet, androgen, oxidative stress and prostate cancer susceptibility. Cancer Metastasis Rev. 17(4), 325-330. 9. Carrozza, MJ., Utley, RT., Workman, JL. and Côté, J. (2003). The diverse functions of histone acetyltransferae complexes. Trends Genet. 19(6), 321-329. 10. Yang, XJ. (2004). The diverse superfamily of lysine acetyltransferases and their roles in leukemia and other diseases. Nucleic Acid Res. 32(3), 959-976. 78

11. Kruszewski, M. and Szumiel, I. (2005). Sirtuins (histone deacetylases III) in the cellular response to DNA damage facts and hypotheses. DNA repair. 4(11), 1306-1313. 12. Sengupta, N. and Seto, E. (2004). Regulation of histone deacetylase activities. J Cell Biochem. 93(1), 57-67. 13. Dokmanovic, M., Clarke, C. and Marks, PA. (2007). Histone deacetylase inhibitors: overview and perspectives. Mol Cancer Res. 5(10), 981-989. 14. Shankar, S. and Srivastava, RK. (2008). Histone deacetylase inhibitors: mechanisms and clinical significance in cancer: HDAC inhibitor-induced apoptosis. Adv Exp Med Biol. 615, 261-298. 15. Drummond, DC., Noble, CO., Kirpotin, DB., Guo, Z., Scott, GK. and Benz, CC. (2005). Clinical development of histone deacetylase inhibitors as anticancer agents. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 45, 495-528. 16. Vanhaecke, T., Papeleu P., Elaut, G. and Rogiers, V. (2004). Trichostatin A-like hydroxamate histone deacetylase inhibitors as therapeutic agents: toxicological point of view. Curr Med Chem. 11(12), 1629-1643. 17. Bitterman, KJ., Anderson RM., Cohen, HY., Latorre-Esteves, M. and Sinclair, DA. (2002). Inhibition of silencing and accelerated aging by nicotinamide, a putative negative regulator of yeast sir2 and human SIRT1. J Biol Chem. 277(47), 45099-45107. 18. Grozinger, CM., Chao, ED., Blackwell, HE., Moazed, D. and Schreiber, SL. (2001). Identification of a class of small molecule inhibitors of the sirtuin family of NADdependent deacetylases by phenotypic screening. J Biol Chem. 276(42), 38837-38843. 79

19. Chanvitayapongs, S., Draczynska-Lusiak, B. and Sun, AY. (1997). Amelioration of oxidative stress by antioxidants and resveratrol in PC12 cells. Neuroreport. 8(6), 1499-1502. 20. Howitz, KT., Bitterman, KJ., Cohen HY., Lamming, DW., Lavu, S., Wood, JG., Zipkin RE., Chung, P., Kisielewski, A., Zhang, LL., Scherer, B. and Sinclair, DA. (2003). Small molecule activators of sirtuins extend Saccharomyces cerevisiae lifespan. Nature. 425(6954), 191-196. 21. Fontecave, M., Lepoivre, M., Elleingand, E., Gerez, C. and Guittet, O. (1998). Resveratrol, a remarkable inhibitor of ribonucleotide reductase. FEBS Lett. 421(3), 277-279. 22. Ragione, FD., Cucciolla, V., Borriello, A., Pietra, VD., Racioppi, L., Soldati, G., Manna, C., Galletti, P. and Zappia, V. (1998). Resveratrol arrests the cell division cycle at S/G2 phase transition. Biochem Biophys Res Commun. 250(1), 53-58. 23. Dorrie, J., Gerauer, H., Wachter, Y. and Zunino, SJ. (2001). Resveratrol induces extensive apoptosis by depolarizing mitochondrial membranes and activating caspase-9 in acute lymphoblastic leukemia cells. Cancer Res. 61(12), 4731-4739. 24. Khan, N., Adhami, VM. and Mukhtar, H. (2010). Apoptosis by dietary agents for prevention and treatment of prostate cancer. Endocrine-Related Cancer. 17(1), 39-52. 25. Milne, JC., Lambert, PD., Schenk, S., Carney, DP., Smith, JJ., Gagne, DJ., Jin, L., Boss, O., Perni, RB., Vu, CB., Bemis, JE., Xie, R., Disch, JS., Ng, PY., Nunes, JJ., Lynch, AV., Yang, H., Galonek, H., Israelian, K., Choy, W., Iffland, A., Lavu, S., Medvedik, O., Sinclair, DA., Olefsky, JM., Jirousek, MR., Elliott, PJ. and Westphal, CH. (2007). Small molecule 81

activators of SIRT1 as therapeutics for the treatment of type 2 diabetes. Nature. 450(7170), 712-716. 26. Fu, M. and Yang, T. (2006). Hormonal control of androgen receptor function through SIRT1. Mol Cell Bio. 26(21), 8122-8135. 27. Sauve, AA., Wolberger, C., Schramm, VL. and Boeke, JD. (2006). The biochemistry of sirtuins. Annu. Rev. Biochem. 75, 435-465. 28. Brachmann, B., Sherman, JM., Devine, SE., Cameron, EE., Pillus L. and Boeke, JD. (1995). The SIR2 gene family, conserved from bacteria to humans, functions in silencing, cell cycle progression and chromosome stability. Genes Dev. 9(23), 2888-2902. 29. McCay, CM., Crowell, MF. and Maynard, LA. (1989). The effect of retarded growth upon the length of life span and upon the ultimate body size. Nutrition. 5(3), 155-171. 30. Guarente, L. and Picard, F. (2005). Calorie restriction, the SIR2 connection. Cell. 120(4), 473-482. 31. Frye, RA. (2000). Phylogenetic classification of prokaryotic and eukaryotic SIR2-like proteins. Biochem Biophys Res Commun. 273(2), 793-798. 32. Yang, Y., Hou, H., Haller, EM., Nicosia, SV. and Bai, W. (2005). Suppression of FOXO1 activity by FHL2 through SIRT1-mediated deacetylation. EMBO J. 24(5), 1021-1032. 33. Frescas, D., Valenti, L. and Accili, D. (2005). Nuclear trapping of the forkhead transcription factor FOXO1 via SIRT1-dependent deacetylation promotes expression of glucogenetic genes. J. Biol. Chem. 280(21), 20589-20595. 81

34. Li, R., Erdamar, S., Dai, H., Wheeler, TM., Frolov, A., Scardino, PT., Thompson, TC. and Ayala, GE. (2007). Forkhead protein FKHR and its phosphorylated form p-fkhr in human prostate cancer. Hum. Pathol. 38(10), 1501-1507. 35. Celli, GB., Denchi, EL. and De Lange, T. (2006). Ku70 stimulates fusion of dysfunctional telomeres yet protects chromosome ends from homologous recombination. Nat Cell Biol. 8(8), 885-890. 36. Cohen, HY., Lavu, S., Bitterman, KJ., Miller, C., Hekking, B., Imahiyerobo, T., Frye, R., Ploegh, H., Kessier, BM. and Sinclair, DA. (2004a). Acetylation of the C terminus of Ku70 by CBP and PCAF controls Bax-mediated apoptosis. Mol Cell. 13(5), 627-638. 37. Cohen, HY., Miller, C., Bitterman, KJ., Wall, NR., Hekking, B., Kessier, B., Howitz, KT., Gorospe, M., De Cabo, R. and Sinclair, DA. (2004b). Calorie restriction promotes mammalian cell survival by inducing the SIRT1 deacetylase. Science. 305(5682), 390-392. 38. Langley, E., Pearson, M., Faretta, M., Bauer, UM., Frye, RA., Minucci, S., Pelicci, PG. and Kouzarides, T. (2002). Human SIR2 deacetylates p53 and antagonizes PML/p53- induced cellular senescence. EMBOJ. 21(10), 2383-2396. 39. Luo, J., Nikolaev, AY., Imai, S., Chen, D., Su, F., Shiloh, A., Guarente, L. and Gu, W. (2001). Negative control of p53 by SIR2 alpha promotes cell survival understress. Cell. 107(2), 137-148. 40. Motta, MC., Divecha, N., Lemieux, M., Kamel C., Chen, D., Gu, W., Bultsma, Y., McBurney, M. and Guarente, L. (2004). Mammalian SIRT1 represses forkhead transcription factors. Cell. 116(4), 551-563. 41. Brunet, A., Sweeney, LB., Sturgill, JF., Chua, KF., Greer, PL., Lin, Y., Tran, H., Ross, SE., Mostoslavsky, R., Cohen, HY., Hu, LS., Cheng, HL., Jedrychowski, MP., Gygi, SP., 82

Sinclair, DA., Alt, FW. and Greenberg ME. (2004). Stress-dependent regulation of FOXO transcription factors by the SIRT1 deacetylase. Science. 303(5666), 2011-2015. 42. Firestein, R., Blander, G., Michan, S., Oberdoerffer, P., Ogino, S., Campbell, J., Bhimavarapu, A., Luikenhuis, S., De Cabo, R., Fuchs, C., Hahn, WC., Guarente, LP. and Sinclair DA (2008). The SIRT1 deacetylase suppresses intestinal tumorgenesis and colon cancer growth. PLoS One. 3(4), e2020. 43. Vaziri, H., Dessain, SK., Ng Eaton, E., Imai, SI., Frye, RA., Pandita, TK., Guarente, L. and Weinberg, RA. (2001). hsir2(sirt1) functions as an NAD-dependent p53 deacetylase. Cell. 107(2), 149-159. 44. Cheng, HL., Mostoslavsky, R., Saito, S., Manis, JP., Gu, Y., Patel, P., Bronson, R., Appella, E., Alt, FW. and Chua, KF. (2003). Developmental defects and p53 hyperacetylation in Sir2 homolog (SIRT1)-deficient mice. Proc Natl Acad Sci USA. 100(19), 10794-10799. 45. Horn, TL., Cwik, MJ., Morrissey, RL., Kapetanovic, I., Crowell, JA., Booth, TD. and McCormick, DL. (2007). Oncogenicity evaluation of resveratrol in p53(+/-) (p53 knockout) mice. Food Chem Toxicol. 45(1), 55-63. 46. Kim, EJ. and Um, SJ. (2008). SIRT1: roles in aging and cancer. BMB Rep. 41(11), 751-756. 47. Chang-Su, Lim. (2006). SIRT1: Tumor promoter or tumor suppressor?. Medical Hypothesis. 67(2), 341-344. 48. Bakshi, S., Bergman, M., Dovrat, S. and Grossman, S. (2004). Unique natural antioxidant (NAOs) and derived purified component inhibit cell cycle progression by 83

downregulation of pprb and E2F in PC3 protate cencer cells. J FEBS. 573(1-3), 31-37. 49. Tannin-Spitz, T., Grossman, S., Dovrat, S., Gottlieb, HE. and Bergman, M. (2007). Growth inhibitory activity of cucurbitacin glucosides isolated from Citrullus colocynthis on human breast cancer cells. Biochem. Pharmacol. 73(1), 56-67. 50. How, DX. (2003). Potential mechanisms of cancer chemoprevention by anthocyanins. Curr. Mol. Med. 3(2), 149-159. 51. Albeck, M. and Grossman, S. (1990) Antioxidant compositions and methods. U.S.A patent 4,923,697. 52. Grossman, S. and Albeck, M. Antioxidant compositions containing fat. U.S.A. patent 4,997,666. 53. Bergman, M., Varshavsky, L., Gottlieb, HE. and Grossman, S. (2001). The antioxidant activity of aqueous spinach extract: chemical identification of active fractions. Phytochemistry. 58(1), 143-152. 54. Bergman, M., Perelman, A., Dubinsky, Z. and Grossman, S. (2003). Scavenging of reactive oxygen speccies by a novel glucurinated flavonoid antioxidant isolared and purified form spinach. Phytochemistry. 62(5), 753-762. 55. Wasfi, I.A. (1994). J. Herbs, Spices Medical Plants. 2, 65-71. 56. Adam, SEI., Al-Yahya, HA. and Al-Farhan, AH. (2001). Response of Najdi sheep to oral administration of Citrullus colocynthis fruits, Nerium oleander leaves or their mixture. Small Rumin. Res. 40(3), 239-244. 57. Hatam, NR., Whiting, DA. and Yousfi, NJ. (1989). Cucorbitacin glycosides from Citrullus colocynthis. Phytochemistry. 28, 1268-1274. 84

58. Ser, C., Sturm, S., Mai, ME., Ellmerer, EP. and Stuppner, H. (2005). 1H and 13C NMR signal assignment of cucurbitacin derivatives from Citrullus colocynthis (L). Schrader and Ecballium elaterium L. (Cucurbitaceae). Magn. Reson. Chem. 43(6), 489-495. 59. Chen, JC., Chiu, MH., Nie, RL., Cordell, GA. and Qiu, SX. (2005). Cucurbitacins and cucurbitane glycosides: structures and biological activities. Nat. Pord. Rep. 22(6), 386-399. 60. Jayaprakasam, B., Seeram, NP. and Nair, MG. (2003). Anticancer and antiinflammatory activities of cucurbitacins from Cucurbita andreana. Cancer Lett. 189(1), 11-16. 61. Ito, A., Chai, HB., Lee, D., Kardono, LB., Riswan, S., Farnsworth, NR., Cordell, GA., Pezzuto, JM. and Kinghorn, AD. (2002). Ellagic acid derivatives and cytotoxic cucurbitacins from Elaeocarpus mastersii. Phytochem. 61(2), 171-174. 62. Lauro, L. and Rolih, C. (1990). Observations and research on an extract of Inula viscose. Boll. Soc. Ital. Biol. Sper. 66(9), 829-835. 63. Ali-Shtayeh, MS., Yaghmour, RM., Faidi, YR., Salem, K. and Al-Nuri, MA. (1998). Antimicrobial activity of 20 plants used in folkloric medicin Palestinian area. J. Ethnopharmacol. 60(3), 265-271. 64. Zeggwagh, NA., Ouahidi, ML., Lemhadri, A. and Eddouks, M. (2006). Study of hypoglycaemic and hypolipidemic effects of Inula viscosa L. aqueous extract in normal and diabetic rats. J Ethnopharmacol. 108(2), 223-227. 85

65. Danino, O., Gottlieb, H., Grossman, S. and Bergman, M. (2009). Antioxidant activity of 1,3-dicaffeoylquinic acid isolated from Inula viscose. Food Research International. 42, 1273-1280. 66. Peluso, G., De Feo, V., De Simone, F., Bresciano, E. and Vuotto, ML. (1995). Studies on the inhibitory effects of caffeoylquinic acids on monocyte migration and superoxide ion production. J Nat Prod. 58(5), 639-646. 67. Iwai, K., Kishimoto, N., Kakino, Y., Mochida, K. and Fujita, T. (2004). In vitro antioxidative effects and tyrosinase inhibitory activities of seven hydroxycinnamoyl derivatives in green coffee beans. J Agric Food Chem. 52(15), 4893-4898. 68. Mazza, G. and Maniati, E. (1993). Anthocyanins in fruits, vegetables, and grains. FL: CRC Press, Boca Raton. 26, 117-123. 69. Folts, J. (1998). Antithrombotic potential of graph juice and red wine for preventing heart attack. Pharm. Biol. 36, 21-27. 70. Tsuda, T., Horio, F., Uchida, K., Aoki, H. and Osawa, T. (2003). Dietary cyanidin-3-o-βglucoside rich-purple corn color prevents obesity and ameliorates hyperglycemia in mice. J. Nutr. 133(7), 2125-2130. 71. Tsuda, T. (2008). Regulation of adipocyte function by anthocyanins; possibility of preventing the metabolic syndrome. J. Agric. Food. Chem. 56(3), 642-646. 72. Prior, RL., Wu, X., Gu, L., Hager, TJ., Hager, A. and Howard, LR. (2008). Whole Berries versus Berry Anthocyanins: Interactions with Dietary Fat Levels in the C57BL/6J Mouse Model of Obesity. J. Agric. Food. Chem. 56(3), 647-653. 73. Rodrigo, KA., Rawal, Y., Renner, RJ., Schwartz, SJ., Tian, Q., Larsen, PE. and Mallery, SR. (2006). Suppression of the tumorigenic phenotype in human oral squamous cell 86

carcinoma cells by an ethanol extract drive from freeze-dried black raspberries. Nutr. Cancer. 54(1), 58-68. 74. Chen, PN., Chu, SC., Chiou, HL., Kuo, WH., Chaing, CL. and Hsieh, YS. (2006). Mulberry anthocyanins, cyaniding-3-rutinoside and cyaniding-3-glucoside, exhibited an inhibitory effect on the migration and invasion of a human lung cancer cell line. Cancer Lett. 235(2), 248-259. 75. Matsumoto, H., Inaba, H., Kishi, M., Tominaga, S., Hirayama, M. and Tsuda, T. (2001). Orally administered delphinidin-3-rutinoside and cyaniding-3-rutinoside are directly absorbed in rats and humans and appear in the blood as the intact form. J. Agric. Food. Chem. 49(3), 1546-1551. 76. Matsumoto, H., Nakamura, Y., Tachibanaki, S., Kawamura, S. and Hirayama, M. (2003). Stimulatory effect of cyaniding-3-glycosides on the regeneration of rhodopsin. J. Agric. Food. Chem. 51(12), 3560-3563. 77. Wettasinghe, M., Bolling, B., Plhak, L., Xiao, H. and Parkin, K. (2002). Phase II enzyme inducing antioxidant activities of beetroot extract from phenotypes of different pigmentation. J. Agric. Food Chem. 50(23), 6704-6709. 78. Jost, LM., Kirkwood, JM. and Whiteside, TL. (1992). Improved short- and long-term XTT-based colorimetric cellular cytotoxicity assay for melanoma and other tumor cells. J Immunol Methods. 147(2), 153-165. 79. Jain, MG., Hislop, GT., Howe, GR. and Ghadirian, P. (1999). Plant foods, antioxidants and prostate cancer risk: findings from case-control studies in Canada. Nutr. Cancer. 34(2), 173-184. 80. Cohen, JH., Kristal, AR. and Stanford, JL. (2000). Fruit and vegetable intakes and prostate cancer risk. J. Natl. Cancer Inst. 92(1), 61-68. 87

81. Kang, SY., Seeram, NP., Nair, MG. and Bourquin, LD. (2003). Tart cherry anthocyanins inhibit tumor development in Apc(Min) mice and reduce proliferation of human colon cancer cells. Cancer Lett. 194(1), 13-19. 82. How, DX., Kai, K., Li, JJ., Lin, S., Terahara, N., Wakamatsu, M., Fujii, M., Young, MR. and Colburn, N. (2004). Anthocyanidins inhibit activator protein 1 activity and cell transformation: structure activity relationship and molecular mechanism. Carcinogenesis. 25(1), 29-36. 88

Abstract Prostate cancer is an age-related malignancy. According to estimates from the American Cancer Society, a man's chance of developing this cancer significantly increases with increasing age, from 1 in 2,500 by age 45 to 1 in 9 by age 75. Therefore, it is important to identify and understand the connection between mechanisms of aging and prostate cancer. Previous research [1], that examined this connection, has shown that SIRT1, a NAD+ dependent HDAC protein, is significantly overexpressed in human prostate cancer cells PC3, compared with normal prostate epithelial cells PrEC, at protein and enzymatic activity levels. In light of the above, we assumed that SIRT1 inhibition at the protein and enzymatic activity levels will result in significant inhibition of the development of Prostate cancer. The aim of this work was to find a molecule that decreases the levels and inhibits the enzymatic activity of SIRT1 protein in PC3 cells. To this purpose, we examined four natural compounds and checked their influence on the in vitro deacetylation activity of SIRT1. Amongst the four natural compounds that were examined, we found that NAO (Natural Antioxidant), a polyphenol mixture from spinach leaves, was the strongest inhibitor of in vitro deacetylation activity of SIRT1. We also found that NAO decreased the SIRT1 protein level in PC3 cells. In addition, we found that NAO inhibits the enzymatic activity of SIRT1 in PC3, as indicated by increased acetylation levels of p53. The preventive effect of NAO on prostate cancer, by decreasing the levels and inhibiting deacetylation activity of SIRT1 and by additional mechanisms [48], indicates that NAO can serves as a clinical compound for prostate cancer management. 89

This work was carried out under the supervision of Prof. Shlomo Grossman and Dr. Haim Cohen The Mina and Everard Goodman Faculty of Life Sciences, Bar-Ilan University 91

The Mina & Everard Goodman Faculty of Life Sciense Bar-Ilan University Effect of natural antioxidants on the level and activity of SIRT1 protein in cell line of human prostate cancer Shay Lubel 066462391 Submitted in partial fulfillment of the requirements for the Master's degree in the faculty of Life sciences Bar-Ilan University Ramat Gan, Israel 2011 91